產品參數：
| 中文名稱 | 英文名稱 | 產品規格 | 產品貨號 |
| MTT檢測試劑盒 | MTT Assay Kit | 500次 | BJ-01X6322 |
MTT廣泛用于檢測細胞生長，其原理是MTT可以被活細胞線粒體內的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結晶，而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細胞的活力，細胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。
商品詳細介紹：
| 產品特點： 1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。 2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復性好。 3．本產品為足夠500次(5個96孔細胞培養板)微孔板檢測。 4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。 儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。 使用方法： 下面操作是檢測細胞毒性的試驗，其他應用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎稍作修改即可，故不再贅述。 ㈠、接種細胞 1．按常規消化法消化匯合的單層細胞，收集到含血清的培養基中。 2．200g離心5分鐘收集細胞沉淀。 3．用培養基重懸細胞沉淀，制備成單細胞懸浮液并計數。 4．將細胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據細胞的生長速度決定)，如果不知道生長數度，一般可以稀釋到1×10個/mL。 5．將足夠量的細胞懸液轉移到培養皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。 6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞，則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養基(總體積為200μL)。注意：一定要把細胞加在孔的正中，否則細胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。 7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養基。第1 列各孔將作為+培養基-細胞+MTT對照(用于測OD時調零)，第12列加培養基的作用是減少邊緣效應對第11 列反應的影響。 8．按常規細胞培養方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細胞進入指數生長期。 ㈡、藥物處理 9．用培養基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。 10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養基(不要觸動細胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養基。 11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養基，這些孔將作為+培養基+細胞-藥物的對照。 12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。 13．按常規方法把96孔板繼續放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細胞的時間，由用戶自己決定。 14．處理結束后去除第2 到第11列(共10列，均含細胞)所有孔中的培養基，并再加入100μL新鮮培養基。 15．每天換培養使細胞數量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。 ㈢、存活細胞計數 16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養基后，再加入100μL新鮮培養基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續培養4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。 17．小心吸棄孔內培養基(含溶液A)。由于培養基可能會影響光吸收，最好盡可能去除。 18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結晶物充分溶解。 19．由于產物不穩定，故需要立即在酶聯免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。 ?注意：用第1 列各孔(+培養基-細胞+MTT對照)調零。 20．計數同樣處理的各次重復的平均值。 21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數據的平均數作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現S型，具有促進作用的則斜率加大。 |
實驗報告：
一、分離與培養：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；
5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
培養操作步驟 ：
1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；
2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養板（每孔一片）或培養皿中（每個平皿可放置2-3片）；
3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；
4．將經過計數的細胞懸浮液移入培養板中，使蓋玻片*浸在培養液中；
5．將培養板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養板底部2/3面積時，將培養板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。 
實驗要點及說明：
1．本方法適用于貼壁細胞培養，而不適用于懸浮細胞培養，懸浮細胞可使用滴片法；
2．所使用的蓋玻片應該為優質玻璃，并經過鉻酸洗液處理；
3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；
4．如果需要更多生長狀態一致的細胞，可以使用較大的培養皿，但不宜過大，以避免培養液的浪費和增加污染機率；
5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。
操作要點：
1）將培養基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養基。
2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產生氣泡。用新鮮培養基洗管壁2次，均轉移至離心管內。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養基，吹打制成細胞懸液。
5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養。
6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養基以去除死細胞。繼續培養，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續的實驗。
血管緊張素1轉換酶抑制劑抗體
拮抗凋亡轉錄因子抗體
α-1抗胰
ATP結合蛋白家族6抗體
三磷酸腺苷結合盒亞家族G1抗體
脂聯素受體2抗體
ANGEL1蛋白抗體
ANGEL2蛋白抗體
ANKLE2蛋白抗體
睪丸特異性錨樣蛋白1抗體
錨蛋白重復結構域蛋白13B抗體
錨蛋白重復結構域蛋白20A1抗體
錨蛋白重復結構域蛋白20A3抗體
錨蛋白重復結構域蛋白22抗體
錨蛋白重復結構域蛋白50抗體
BC-020(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2
BC-021(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2
BC-022(人乳腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2
BE(2)-M17(人神經母細胞瘤細胞) 5×106cells/瓶×2
BGC-803(人胃癌細胞) 5×106cells/瓶×2
C918(人眼脈絡黑色素瘤細胞) 5×106cells/瓶×2
CAL-27(人舌鱗癌細胞) 5×106cells/瓶×2
LS 180(人結腸腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2
CNE-2Z(人鼻咽癌細胞) 5×106cells/瓶×2
MTT檢測試劑盒COLO 201(人結直腸腺癌細胞) 5×106cells/瓶×2
CW-2(人結腸癌細胞) 5×106cells/瓶×2
CRT(人神經膠質瘤細胞) 5×106cells/瓶×2
D283 Med(人腦髓母細胞瘤細胞) 5×106cells/瓶×2
EA.hy926(人臍靜脈細胞融合細胞) 5×106cells/瓶×2
ECV-304(人臍靜脈內皮細胞) 5×106cells/瓶×2
EJ(人膀胱癌細胞) 5×106cells/瓶×2
H-97(人高轉移肝癌細胞) 5×106cells/瓶×2
