PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

PKH67；PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking體內(nèi)細(xì)胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

產(chǎn)品信息

【好消息】：應(yīng)客戶的要求，我司對試劑盒內(nèi)的Diluent C可單獨(dú)供應(yīng)，產(chǎn)品信息如下：

產(chǎn)品描述

PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于熒光探針PKH67，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記的檢測試劑盒，適用于體外細(xì)胞標(biāo)記，體外細(xì)胞增殖以及長期的體內(nèi)細(xì)胞跟蹤研究等。

PKH67是一種專li的膜標(biāo)記探針，與PKH1和PKH2相比，結(jié)構(gòu)上帶有更長的脂肪族碳尾，能穩(wěn)定插入細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)域。正因具更長碳尾，內(nèi)部數(shù)據(jù)連續(xù)性證明：PKH67具有比PKH2更低的細(xì)胞-細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生。PKH67呈綠色熒光（見圖1），最大激發(fā)波長為490nm，最大發(fā)射波長是502nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常適合用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，與碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放線jun素D（7-AAD，MX4215）這些細(xì)胞活力探針聯(lián)合使用，或者與橙-紅色熒光探針比如藻紅蛋白（PE，MX4698）、紅色熒光蛋白（RFP）等結(jié)合使用。根據(jù)染料稀釋原理，PKH67常用于細(xì)胞增殖監(jiān)測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶干細(xì)胞特性的靜息/緩慢分化腫瘤細(xì)胞的鑒定。也能用于監(jiān)測外泌體或脂質(zhì)體吞噬，細(xì)胞-細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬、抗原遞呈，以及體內(nèi)細(xì)胞運(yùn)輸研究。

以不分裂細(xì)胞為研究對象，通過對體外細(xì)胞膜滯留周期和體內(nèi)熒光強(qiáng)度減弱頻率的關(guān)聯(lián)性分析，預(yù)測PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。這與PKH1和PKH2的體內(nèi)半衰期相近，這兩個(gè)探針都成功用于監(jiān)測周期長達(dá)1-2個(gè)月的體內(nèi)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞運(yùn)輸研究，因此，PKH67適用于需要綠色熒光細(xì)胞連接染料的短-中期體內(nèi)示蹤研究，以及體外細(xì)胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一種水溶性溶液，特別設(shè)計(jì)的一種標(biāo)記媒介能維持細(xì)胞活力，同時(shí)zui大化染料溶解性和標(biāo)記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說是等滲的，不含去污劑或有機(jī)溶劑，也不含生理鹽和緩沖劑。根據(jù)細(xì)胞類型，染料標(biāo)記后膜的內(nèi)在化程度，標(biāo)記細(xì)胞可能呈現(xiàn)不同的狀態(tài)，從明亮，到均勻點(diǎn)狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光在生理范圍內(nèi)不依賴于pH，且每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度通常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

我司（懋康生物）提供三種規(guī)格的PKH67細(xì)胞連接試劑盒（用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建議用于小量或初步研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于5次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定最佳的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）適用于中量研究，比如體外細(xì)胞增殖或毒性研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于30次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定最佳的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）適用于大量或體內(nèi)研究。當(dāng)使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次），和足量的Diluent C用于30次細(xì)胞樣本（2×107個(gè)細(xì)胞/次）。用戶需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩韮?yōu)化確定最佳的染料濃度。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸方法

保存：2-8oC避光保存，1年有效。其中組分A（PKH67 Dye）需嚴(yán)格避光，蓋子保持?jǐn)Q緊。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1. PKH67是以溶于乙醇的儲(chǔ)存液形式提供，保存的過程中需避光并擰緊蓋子，以防止溶液揮發(fā)引起的染料濃度提高。使用前需檢查是否有結(jié)晶，若有結(jié)晶，需在37℃水浴溶晶，超聲或渦旋直至完quan溶解。

2. Diluent C使用前需置于室溫回溫之后再配制標(biāo)記用的細(xì)胞和染料工作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生素，使用和保存過程中都注意無菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C內(nèi)，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲(chǔ)存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 自行準(zhǔn)備儀器和試劑（試劑盒不提供，用于常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記）

﹒良好分散，均勻的單細(xì)胞懸液（懸浮于組織培養(yǎng)基）

﹒含血清的組織培養(yǎng)基（完quan培養(yǎng)基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養(yǎng)基，或生理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系統(tǒng)兼容的蛋白

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能控溫的離心機(jī)（高達(dá)1000×g）

﹒熒光分析用儀器（熒光酶標(biāo)板，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀）

﹒無菌層流凈化罩

﹒血球計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×107個(gè)細(xì)胞/ml。

以下所有步驟都在室溫下進(jìn)行（20-25℃）。

1. 取一錐底聚丙烯離心管制備2×107個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次。

2. 400×g離心細(xì)胞5min，得到松散的細(xì)胞沉淀。

3. 細(xì)胞離心后，輕輕吸掉上清。注意不要移動(dòng)任何細(xì)胞并且殘留不超過25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到細(xì)胞沉淀中制備成2×細(xì)胞懸液，用槍輕輕吹勻以確保完quan分散。不可渦旋和不可讓細(xì)胞長期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通過將4μl PKH67乙醇儲(chǔ)存液到1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細(xì)胞懸液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻后樣本得到的終濃度是1×107個(gè)細(xì)胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細(xì)胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長時(shí)間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他適當(dāng)?shù)鞍兹芤海ū热?% BSA）終止染色，孵育1min允許結(jié)合多余的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細(xì)胞10min，輕輕吸掉上清，確保不會(huì)移動(dòng)細(xì)胞。用10ml完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細(xì)胞5min。然后用10ml完quan培養(yǎng)基清洗細(xì)胞沉淀＞2次，以確保完quan去除未結(jié)合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完quan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用來評估細(xì)胞回收，細(xì)胞活力和染色強(qiáng)度。離心和重懸沉淀到一理想終濃度的活細(xì)胞懸液。

染色示例（來自文獻(xiàn)資源）

1）文獻(xiàn)來源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：為了評估旁觀者凋亡效應(yīng)，靶向THP-1單核細(xì)胞用PKH67來標(biāo)記，最終在熒光顯微鏡觀察以確認(rèn)標(biāo)記是否成功。標(biāo)記好的THP-1細(xì)胞（未感染的旁觀者細(xì)胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬細(xì)胞（感染效應(yīng)細(xì)胞量：0.5 × 105cells/ml），接種到2孔的LabTek腔室玻片。效應(yīng)巨噬細(xì)胞經(jīng)H37Ra感染4h，之后劇烈清洗去除胞外細(xì)菌。之后與未感染的PKH67標(biāo)記旁觀者細(xì)胞共培養(yǎng)，37℃共培養(yǎng)24或48h。孵育后，上清液去除，細(xì)胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR監(jiān)測凋亡，細(xì)胞核用Hochest 33342復(fù)染。用熒光顯微鏡來評估綠色PKH67標(biāo)記巨噬細(xì)胞的旁觀凋亡效應(yīng)。當(dāng)某一個(gè)單細(xì)胞同時(shí)呈綠色（旁觀者）和紅色（凋亡），表明旁觀者凋亡效應(yīng)的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文獻(xiàn)來源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和細(xì)胞因子刺激30min，之后，將1 × 106PKH67標(biāo)記好的凋亡自體中性粒細(xì)胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，紅細(xì)胞用裂解液裂解掉，流式細(xì)胞術(shù)觀察中性粒細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

相關(guān)產(chǎn)品

引用文獻(xiàn)

[1] Yan, F., Cui, W. & Chen, Z. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosome-Loaded microRNA-129-5p Inhibits TRAF3 Expression to Alleviate Apoptosis and Oxidative Stress in Heart Failure. Cardiovasc Toxicol 22, 631–645 

（染色對象：外泌體）

After thawing, the isolated MSC-Exos were labeled using a PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (MX4023, Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China).

[2] Jiao W, Hao J, Liu JM, Gao WN, Zhao JJ, Li YJ. Mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicle-incorporated H19 attenuates cardiac remodeling in rats with heart failure. Kaohsiung J Med Sci. 2024 Jan;40(1):46-62. doi: 10.1002/kjm2.12774. Epub 2023 Oct 27. PMID: 37885317. （染色對象：細(xì)胞外囊體EV）

To observe the uptake of EV by H9C2 cells, we labeled and resuspended MSC-EV in DMEM using the PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling kit (Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) according to the protocol. 

[3] Pan G, Jiang B, Yi Z, Yin J, Liu Y. Exosomal miR-105-5p derived from bladder cancer stem cells targets for GPR12 to promote the malignancy of bladder cancer. BMC Urol. 2023 Oct 3;23(1):155. doi: 10.1186/s12894-023-01326-2. PMID: 37789353; PMCID: PMC10548737.

（染色對象：外泌體）

PKH67 staining assay

Exosome uptake of EJ and T24 cells was analyzed by PKH67 staining assay using the kit according to the manual (MX4023-100UL; Shanghai Maokang Biotech Co., Ltd.). Briefly, 2 × 10⁷ exosomes were collected and resuspended in 1 ml Diluent C. 4 μl of PKH67 solution was added into the resuspension and incubated for 5 min. Then, the PKH67-labeled exosomes were incubated with EJ and T24 cells for 24 h and the cellular location of the exosomes was observed by a fluorescence microscope. DAPI was used to stain the nuclei of the tumor cells.

[4] Wu R, Li J, Aicher A, Jiang K, Tondi S, Dong S, Zheng Q, Tang S, Chen M, Guo Z, ?abanovi? B, Ananthanarayanan P, Jiang L, Sapino A, Wen C, Fu D, Shen B, Heeschen C. Gasdermin C promotes Stemness and Immune Evasion in Pancreatic Cancer via Pyroptosis-Independent Mechanism. Adv Sci (Weinh). 2024 Sep 19:e2308990. doi: 10.1002/advs.202308990. Epub ahead of print. PMID: 39297408.

（染色對象：巨噬細(xì)胞）

In Vitro Macrophage Phagocytosis Assay

PBMC, immortalized Bone Marrow-Derived Macrophage (iBMDM) cells, or THP-1 cells activated with PMA (#S1819, Beyotime, 100 ng mL^?1 for three days) were labeled with PKH26 (#MX4021, MaokangBio), while cancer cells were labeled with PKH67 (#MX4023, MaokangBio), following the manufacturer's instructions. The macrophages were then mixed with the cancer cells at a ratio of 2:1 and seeded onto a 6-well plate. Images were taken at the indicated time points, and the phagocytic index was calculated as the number of phagocytosed cancer cells per 100 macrophages. For anti-CD47 antibody treatment, 10 µg mL^?1 anti-CD47 antibody or isotype IgG was added to the co-culture medium of CHX2000 cells and iBMDM cells at a 1:1 cell ratio. Cancer cell confluence was determined by fluorescent imaging and quantification.

[5] Yao F, Zhao Y, Wang G, Zhao M, Hong X, Ye Z, Dong F, Li W, Deng Q. Exosomal lncRNA ROR1-AS1 from cancer-associated fibroblasts inhibits ferroptosis of lung cancer cells through the IGF2BP1/SLC7A11 signal axis. Cell Signal. 2024 Aug;120:111221. doi: 10.1016/j.cellsig.2024.111221. Epub 2024 May 8. PMID: 38729321.

（染色對象：外泌體）

Exosomes and PKH67 (MX4023, MaoKangBio, Shanghai, China) were diluted, respectively, using diluent C (1 mL, MX4022, MaoKangBio).

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域研究的試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)室消耗品與實(shí)驗(yàn)服務(wù)工作，主要從事細(xì)胞生物學(xué)、植物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)。生物制藥與診斷試劑研發(fā)生產(chǎn)等領(lǐng)域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經(jīng)營理念。堅(jiān)持"品質(zhì)保障"的原則為廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

PKH67細(xì)胞連接試劑盒 熒光探針PKH67細(xì)胞連接試劑盒 熒光探針