鈣激活鉀通道蛋白抗體單抗的標(biāo)記目前動(dòng)物用單抗，在動(dòng)物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測(cè)、性別鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用，大多以診斷試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標(biāo)記的單抗。下面將介紹zui常用的幾種標(biāo)記技術(shù)。
（1） 酶標(biāo)記A、 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記單抗和多克隆抗體的常用方法是過(guò)碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。鈣激活鉀通道蛋白抗體這里介紹兩種程序。
程序一：a. 將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。
b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。
c. 加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。
d. 稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下*玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時(shí)或4℃過(guò)夜。e. 用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）。
f. 將交聯(lián)物過(guò)Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集*峰。g. 酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：克分子比值測(cè)定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結(jié)合率=酶量×體積/抗體，標(biāo)記率一般為0.3-0.6，即1-2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4時(shí)，E/P約為1。標(biāo)記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測(cè)定 可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、DAB-H2O2顯色反應(yīng)測(cè)定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。
h. HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復(fù)凍融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會(huì)影響酶活性。必要時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。
公司產(chǎn)品詳情請(qǐng)參閱有關(guān)詳細(xì)論述鏈接點(diǎn)擊: Human soluble receptor activator of nuclear factor-kB ligand,sRANKL 人可溶性核因子κB受體活化因子配基（sRANKL）
 Human Involucrin,iNV 人套膜蛋白（iNV）
Human tenascin-R,TN-R 人肌腱蛋白R(shí)（TN-R）
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Human Agrin 人聚集蛋白（Agrin）
Human Agouti Related Protein,AGRP 人Agouti相關(guān)蛋白（AGRP）
Human membrane cofactor protein,MCP 人膜輔蛋白（MCP/CD46）
Human elongin A,EloA 人延伸蛋白A（EloA）
Human Acylation Stimulating Protein,ASP 人酰化刺激蛋白（ASP）
Human bactericidal/permeabilityincreasingprotein,BPI 人殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）
Human matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE 人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白（MEPE）
Human replication protein A,RPA-70 人復(fù)制蛋白A（RPA-70）
Human cartilage oligomeric matrix protein,COMP 人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）
Human transporter associated with antigen processing,TAP 人抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/T細(xì)胞活化蛋白（TAP）
   程序二：1. 將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液0.1ml，室溫?cái)嚢枳饔?小時(shí)，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。
2. 再加1ml 0.06mol/L 過(guò)碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色；隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時(shí)，中止氧化反應(yīng)。
3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，更換三次緩沖液，注意避光。
4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時(shí)，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時(shí)或過(guò)夜，或換用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小時(shí)。
5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時(shí)，更換三次緩沖液。
6. 用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，必要時(shí)進(jìn)一步層析純化。7.8. 步驟同程序一。B、 堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記堿性磷酸酶（AP）用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，制備成結(jié)合物。該法簡(jiǎn)便，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，酶標(biāo)記率低。其程序如下：1. 將5mg AP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對(duì)0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時(shí)，換液三次。2. 加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時(shí)，4℃對(duì)PBS透析過(guò)夜，其間換液三次。3. 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過(guò)夜，換液三次。4. 取出標(biāo)記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標(biāo)記物原液。5. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩、 PAP、APAAP的制備PAP（過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）、APAAP（堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）的制備對(duì)于日益廣泛使用單抗的免疫細(xì)胞化學(xué)有重要意義。現(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應(yīng)，只要配以相應(yīng)的橋抗體，即可非常便利地應(yīng)用單抗。因?yàn)镻AP法和APAAP法不用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學(xué)因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水，過(guò)量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應(yīng)，調(diào)PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。根據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應(yīng)橋抗體結(jié)合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測(cè)試驗(yàn)等。