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如何確定RNA質(zhì)量的經(jīng)驗談!

時間:2015/9/6閱讀:605
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  1)檢測RNA溶液的吸光度
  
  280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的,我們只看OD260/OD280(Ratio,R)。1.82.0時,我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的,不過要注意,當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時,R值可能會大于2(一般應(yīng)該是<2.2的)。當(dāng)R<1.8時,溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯,你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當(dāng)R>2.2時,說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
  
  2)RNA的電泳圖譜
  
  一般的,RNA的電泳都是用變性膠進行的,但是根據(jù)我的經(jīng)驗,如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的,用普通的瓊脂糖膠就可以了。
  
  電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值,或者是mRNAsmear的完整性。一般的,如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰),并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,我們認為RNA的質(zhì)量是好。
  
  以上是我們常用的兩種方法,但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的rna酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法我們很難察覺,但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了,當(dāng)然這時你的實驗也就完了。
  
  下面,我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
  
  3)保溫試驗
  
  方法很簡單的,按照樣品濃度,從RNA溶液中吸取兩份1000ng的RNA加入至0.5ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10ul的總體積,然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。
  
  時間到了之后,取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后,比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別(當(dāng)然,它們的條帶也要符合方法2中的條件),則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染,RNA的質(zhì)量很好。相反的,如果70℃保溫的樣本有明顯的降解,則說明RNA溶液中有RNA酶污染。

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