擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性（Amplified Restriction fragment polymorphism，AFLP）是由Zabeau等（1992）發(fā)明，并于1993年獲得歐洲，該的權(quán)現(xiàn)在由荷蘭Keygene公司擁有；被譽(yù)為新一代的分子標(biāo)記技術(shù)。
AFLP實(shí)質(zhì)上是RFLP和RAPD的的結(jié)合和發(fā)展，它繼承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷。AFLP只需要極少量的DNA材料，不需要Sourthern雜交，不需要預(yù)先知道DNA的順序信息，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以提供大量穩(wěn)定可靠的信息。同時(shí)，AFLP產(chǎn)物是典型的孟德?tīng)柗绞竭z傳。
AFLP的基本原理是對(duì)基因組DNA限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。首先用限制性酶產(chǎn)生基因組DNA酶切片段，然后使用雙鏈接頭與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴(kuò)增反應(yīng)的模板。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。引物由三部分組成：①核心堿基序列，該序列與人工接頭互補(bǔ)；②限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列；③引物3’端的選擇堿基。選擇堿基延伸到酶切片段區(qū)，這樣只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制性酶切片段被擴(kuò)增。擴(kuò)增片段通過(guò)變性聚丙烯酰胺電泳分離檢測(cè)。被擴(kuò)增的DNA限制性酶切片段由二個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)生，一個(gè)為酶切位點(diǎn)較少的限制性酶（如EcoR I），另一個(gè)為多酶切位點(diǎn)的限制酶（如Mse I）。所以，AFLP反應(yīng)的結(jié)果是主要擴(kuò)增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。采用雙酶切的原由是：①多位點(diǎn)酶切產(chǎn)生小的DNA片段，這些片段易被擴(kuò)增且片段長(zhǎng)短適宜在變性膠上分離；②切點(diǎn)數(shù)少的酶可減少擴(kuò)增片段的數(shù)目。由于擴(kuò)增片段是由多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶酶切后產(chǎn)生酶切片段，這樣就可選擇擴(kuò)增時(shí)所需的選擇堿基數(shù)目限制在一定的范圍內(nèi)；③利用雙酶切使對(duì)PCR產(chǎn)物的單鏈進(jìn)行標(biāo)記成為可能，從而防止膠上由于擴(kuò)增片段雙鏈遷移率不一致而造成的雙帶現(xiàn)象（doublets）；④雙酶切可以對(duì)擴(kuò)增片段的數(shù)目進(jìn)行使活調(diào)節(jié)；⑤通過(guò)少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋。AFLP技術(shù)包括三個(gè)主要內(nèi)容：①模板的制備；②片段的擴(kuò)增；③聚丙烯酰胺變性膠電泳分離檢測(cè)。
引物的設(shè)計(jì)對(duì)AFLP的成功與至關(guān)重要。引物的設(shè)計(jì)主要取決于人工接頭的設(shè)計(jì)，接頭為雙鏈的寡核苷酸，其設(shè)計(jì)遵循隨機(jī)引物的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)避免自身配對(duì)并具有合適的G、C含量。人工接頭未進(jìn)行磷酸化處理，所以只有一條單鏈被連接在酶切片段末端。Vos等發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果較好的引物都具有5’端以G堿基開(kāi)始的特點(diǎn)，以有效地防止雙鏈的形成，同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)引物3’端寡核苷酸的摻入受dNTP濃度的影響，無(wú)論5’端使何種堿基，dNTP濃度過(guò)低時(shí)雙鏈結(jié)構(gòu)容易產(chǎn)生。對(duì)于雙酶切反應(yīng)來(lái)說(shuō)，引物的組合數(shù)共有（2n）2種（n為選擇堿基的數(shù)目）。引物選擇堿基的數(shù)目一般不超過(guò)三個(gè)，當(dāng)引物具有一個(gè)或二個(gè)選擇堿基時(shí)，引物的特異選擇性較好，選擇堿基增加到三個(gè)時(shí)，引物的選擇特異性仍然不錯(cuò)，但隨著引物選擇堿基的增加，引物與模板的錯(cuò)配頻率相應(yīng)增加，擴(kuò)增的特異性發(fā)生下降。在利用AFLP技術(shù)分析較為復(fù)雜的基因組時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)分為兩個(gè)步驟，先用單選擇堿基引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后再利用多個(gè)選擇堿基（如3個(gè)）的引物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣既可以提高指紋圖譜的清晰度，亦可減少非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。
2 試驗(yàn)條件
【藥品試劑】
5×RL+-Buffer：
50mM Tris·Hac（pH 7.5）
50mM Mg (Ac)2
250mM KAc
25mM DTT
250ng/ml BSA
EcoR I（Pharmacia）
Mse I（N. E. biolabs）
Mse I接頭
EcoR I接頭
10mM atp
T4 dna連接酶