一、從在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液體lb培養(yǎng)基中接種Agrobacterium細(xì)胞，然后在28℃、200-220 rpm培養(yǎng)24 h。然后進(jìn)行質(zhì)粒提取。

二、新鮮配制Sol II溶液（880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH），及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 µl Sol I (P1)溶液。

三、對(duì)培養(yǎng)一晝夜的的Falcon試管在3600 rpm速度下進(jìn)行離心12 min，丟棄上清。

四、用200 µl 5 M NaCl重懸農(nóng)桿菌細(xì)胞，利用渦旋將農(nóng)桿菌細(xì)胞混勻。轉(zhuǎn)移到eppendorf管中。

五、加入20 µl 10% N-Lauroylsarcosine sodium溶液，上下倒置6-8次混勻（從不同方向倒置）。

六、zui大速度（13000 × g）下離心2 min，丟掉上清液。

七、用200 µl含4 mg/ml Lysozyme的Sol I (P1)（Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl (8.0), 10 M EDTA (8.0)）重懸沉淀，渦旋直至混勻。有時(shí)可用微量移液管頭將其攪拌混勻。置于冰上。

八、加入400 µl Sol II (P2)（Sol II: 880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH），上下倒置6-8次混勻（從不同方向倒置）。在冰上放置5 min。

九、加入300 µl Sol III (P3)，用手振蕩。在冰上放置10 min。Sol III = Buffer P3, Neutrilization solution.

十、zui大速度（13000 × g）下離心12 min。

十一、將上清液（700 µl）轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中。

十二、用1× 酚/氯仿（Phenol/Chloroforum，350 µl Phenol +350 µl Chlororum, “Choloforum” is 24 parts chloroforum and 1 part isoamylalcohol）抽提。在通風(fēng)櫥中，往Eppendorf管中加入酚和氯仿（氯仿加入時(shí)要?jiǎng)幼餮杆伲駝t會(huì)吸入微量移液器中）。渦旋15 s，zui大速度（13000 × g）下離心2 min。將上層相（700 µl）小心移入新的Eppendorf管中。傾斜吸取，防止吸入下層的酚/氯仿。注意所有使用過(guò)的吸頭都放入通風(fēng)櫥內(nèi)的有毒拉圾箱內(nèi)。酚/氯仿殘留液倒入通風(fēng)櫥下面柜子里的酚/氯仿廢液瓶中。

十三、用700 µl isopropanel沉淀，室溫下放置5 min。

十四、zui大速度（13000 × g）下離心15 min，小心除去上清。可分兩步，先用大移液管移走大部分上清，剩余50 µl左右再離心5 min。注意沉淀小球并不一定牢固吸在管壁上，小心不要吸走沉淀。

十五、用70%酒精洗滌。加入1 ml 70%酒精，zui大速度（13000 × g）下離心5 min，小心移去上清。室溫下晾干。

十六、20 µl TE + 10 mg/ml RNase A重懸沉淀。在冷室放置一晝夜，后貯于-20℃冰箱。