PCR的假陽(yáng)性問(wèn)題深受重視，但我個(gè)人認(rèn)為PCR假陰性問(wèn)題相對(duì)于臨床檢測(cè)更為嚴(yán)重。其實(shí)PCR假陽(yáng)性的問(wèn)題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問(wèn)題。而污染可以通過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理，合理的環(huán)境設(shè)置，以及加入U(xiǎn)NG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問(wèn)題基本屬于廠家試劑質(zhì)量問(wèn)題。而PCR的假陰性卻不同，它涉及了與PCR實(shí)驗(yàn)的幾乎所有人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，大三陽(yáng)檢出率低、甚至于GC鏡下都很多時(shí)，PCR仍為陰性的事情也經(jīng)常發(fā)生，可見(jiàn)假陰性問(wèn)題的嚴(yán)重性。

　　就PCR假陰性問(wèn)題總體來(lái)說(shuō)有如下因素：

　　一． 儀器因素

　　PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的依賴性是很高的，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要問(wèn)題是孔間差，引起擴(kuò)增失敗可擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響則更容易被忽視。國(guó)內(nèi)使用離心機(jī)很少使用離心加速度（XXXg）作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù)指標(biāo)，這里就存在著一個(gè)問(wèn)題，由于離心機(jī)的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大(有的在數(shù)倍以上)，所以在相同的離心時(shí)間下，有可能模板并沒(méi)有離心下來(lái)，造成PCR假陰性。這個(gè)問(wèn)題在其他實(shí)驗(yàn)也有，但因基他實(shí)驗(yàn)都是測(cè)定大分子蛋白沉淀，對(duì)離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺(tái)式離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)要注意一下這個(gè)問(wèn)題。

　　二． 試劑質(zhì)量問(wèn)題

　　PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問(wèn)題涉及多個(gè)方面：細(xì)胞的裂解；模板的抽提；引物位點(diǎn)的選擇；taq酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問(wèn)題都會(huì)引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問(wèn)題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。

　　三． 核酸模板問(wèn)題

　　核酸模板質(zhì)量問(wèn)題是制約PCRzui重要的因素之一。核酸模板在擴(kuò)增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附、空間位阻等模板質(zhì)量問(wèn)題都有可能引起擴(kuò)增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準(zhǔn)確。由于無(wú)論什么提取方法都不可能得到*理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)，但它不可能由試劑質(zhì)量完*。

　　核酸模板問(wèn)題除了模板本身的問(wèn)題外，還存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、離子等）作用，而導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低甚至擴(kuò)增失敗的問(wèn)題。對(duì)此，有人提倡進(jìn)行模板純化，效果較為明顯。但另一個(gè)問(wèn)題又出現(xiàn)了，那就是怎樣保證純化的回收率問(wèn)題。總之，核酸模板問(wèn)題是不可避免的問(wèn)題，只能努力去減少。

　　四． 操作人員素質(zhì)問(wèn)題

　　PCR實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，而且對(duì)每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計(jì)錯(cuò)誤、對(duì)于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實(shí)驗(yàn)操作人員有很好的素質(zhì)，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題和解決問(wèn)題。

　　五． 其他

　　PCR實(shí)驗(yàn)中從樣品的采集、運(yùn)輸、保存開(kāi)始就可以引起結(jié)果的假陰性，而對(duì)于病原體檢測(cè)（如HBV）在人體血液系統(tǒng)出現(xiàn)有周期性變化也是值得注意的因素。