DNA克隆技術是70年代分子生物學發展的重大成果，用限制性內切酶直接切割分離某個外源DNA片段，與此同時用同一種限制性內切酶切割載體DNA，兩個DNA產生同樣的粘性末端，將它們混合后，二者的粘性末端通過堿基間氫鍵配對而互補。然后在T4DNA連接酶作用下，使外源DNA片段和載體連接而成為完整的重組DNA分子。

現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌DNA的短區段，其中含有β-半乳糖苷酶基因的調控序列和N端146個氨基酸的編碼信息。宿主的染色體上帶有β-半乳糖苷酶C端的編碼序列。宿主和質粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以結合為一體，形成具有酶活性的蛋白質。這樣，質粒載體與LacZ基因上缺失近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體之間實現互補，這種現象稱為α-β-D-半乳糖苷存在下形成藍色菌落。當外源dna片段插入到質粒的多克隆位點后，將產生無α互補能力的質粒，由這種質粒轉化的大腸桿菌形成白色菌落。

抗生素平板選擇標記：

ppUC19質粒帶有氨芐青霉素抗性基因，而JM109宿主菌對氨芐青霉素沒有抗性。在用pUC19質粒轉化JM109后，涂布到含有氨芐青霉素的培養基上培養，沒有被轉化的菌不能生長，而被轉化了的菌可以正常生長，形成菌落。

β-半乳糖苷酶系統篩選(藍、白斑篩選)：

pUC19質粒帶有一個大腸桿菌DNA的短區段, 其中含有β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的調控序列和頭146個氨基酸的編碼信息。JM109宿主菌染色體上帶有Lac Z的C端部分編碼信息，它們編碼的肽段各自都不具有酶活性, 但它們在同一細胞內可以通過非共價鍵結合起來, 形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質。質粒載體與Lac Z基因上缺失近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶陰性的大腸桿菌突變體之間的這種互補作用稱為α互補。

1實驗目的：

掌握CaCl2法將載體(質粒)轉化入受體(大腸桿菌)的實驗技術

2 實驗步驟：

2.1 配選擇培養基平板：

2.1.1 LB液體培養基: 1g蛋白胨, 0.5g酵母粉, 1g NaCl, 加重蒸水100ml，用NaOH調pH至7.0，高壓滅菌。(每組配50ml)

2.1.2 LB固體培養基: 在40ml未高壓滅菌的LB液體培養基中加1.5%瓊脂，高壓滅菌后取出。當培養基冷卻到約50℃時，加入氨芐青霉素母液(500mg/ml)，使其終濃度為200μg/ml，搖勻后迅速倒成兩個平板。(高壓滅菌同時也滅菌兩套洗凈的培養皿)

2.1.3 在超凈工作臺上，往倒好的每個平板培養基上涂布40μl X-gal貯備液(80mg/ml)和4μl IPTG貯備液(200mg/ml)，將平板置于室溫放置3-4h直至液體被吸收。

2.2 制備感受態細胞

2.2.1 取大腸桿菌JM109劃線培養過夜的單菌落接種到20mlLB液體培養基中，置37℃搖床于280rpm振搖培養約6h。

2.2.2 將細菌轉移到一個無菌離心管中，冰上放置10min，使培養物冷卻到0℃。

2.2.3 以4000rpm離心10min，回收細胞，棄上清，將管倒置使殘留的痕量培養液盡量流盡。

2.2.4 以1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2懸浮沉淀，放置于冰浴。

2.2.5 以2000rpm離心10min，回收細胞且使培養液流盡。

2.2.6 取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，將細胞分成200μl一份，裝入Eppendorf管中，置4℃冰箱備用。此時的細胞為感受態細胞。

2.3 轉化

2.3.1 取2管200μl的感受態細胞，1管中加入50 ng pUC19的DNA，另1管為不加質粒DNA的對照，輕輕旋轉以混勻內容物，冰上放置30min。

2.3.2 將管放到42℃水浴中1.5min，不要搖。然后在冰浴中迅速冷卻 2min。(熱激反應)

2.3.3 每管加入100μl LB培養基，37℃水浴中溫育45min。

2.4 培養

2.4.1 取200μl菌液加在含有氨芐青霉素及X-Gal和IPTG的選擇平板培養基上，用一無菌彎頭玻棒輕輕將細菌涂在瓊脂平板表面，將平板置于室溫直至液體被吸收。經質粒轉化的細菌和未轉化的對照各涂布一個平板。

2.4.2倒置平皿37℃培養12-16h，對照培養皿中應無菌落出現，涂布有經質粒轉化細菌的培養皿中長出藍色菌落。

2.4.3 第二天上午觀察結果，記錄現象，并大致估計各皿的菌落數。