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上海士鋒生物科技有限公司
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士鋒生物氨基轉換作用

時間:2014/5/5閱讀:801
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體內α-氨基酸的α-氨基在氨基轉換酶的作用下,移換至α-酮酸的過程,稱氨基轉換作用。

此類酶各有一定的特異性,普遍存在于動物各組織中。 

本實驗是將谷氨酸與丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙酮酸氨基轉換酶(簡稱谷-丙轉氨酶)的作用下進行氨基轉化反應,然后用紙層析法檢查反應體系中丙氨酸的生成。

其反應過程如下: 

氨基轉換作用 
由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代謝途徑分解和轉化,影響氨基轉換過程的觀察,因此在反應體系中添加碘醋酸(或溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代謝過程。 

試劑和器材 
一、試劑 
1%谷氨酸溶液(用1% KOH溶液調到中性);1%丙酮酸鈉溶液(用1% KOH溶液調到中性);0.1%KHCO3溶液;0.025%溴醋酸溶液(用1% KOH溶液調到中性);2% Hac溶液;0.1%標準谷氨酸溶液;0.1%標準丙氨酸溶液;1%KOH溶液。 
展開劑:酚飽和水溶液:2份酚加1份水混合放入分液漏斗,振蕩。靜置24小時后分層,取下層酚置瓶中備用; 
顯色劑:0.1%茚三酮正丁醇溶液。 
二、材料 
肌肉糜:取兔子肌肉2g,置研缽中,加0.9% 氯化鈉溶液6mL,在低溫下研磨成細漿,離心5分鐘(3000轉/分),棄去沉淀,得肌肉糜提取液。 
三、器材 
試管1.5×15cm(′ 4);研缽(或玻璃勻漿器);毛細管;燒杯;恒溫水浴;培養皿9cm(′ 2);直徑13cm圓形濾紙;噴霧器;吹風機。 

操作方法 
一、轉氨酶作用 
1、取試管2只編號(1、2),向每個試管各加0.5mL 1%谷氨酸溶液,0.5mL 1%丙酮酸鈉溶液,0.5mL 0.1%K HCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸, 混勻。然后分別加入肌肉糜提取液0.5ml,混勻,將其中一制試管立即在沸水浴中加熱2-3分鐘做對照。用塞子塞住另一只試管,置于45℃水浴中保溫60min。 
3、保溫完畢,取出試管。向每只試管中各加2% Hac溶液4滴,再置于沸水浴中2min,使蛋白質*沉淀。過濾收集濾液待用。 
三、層析驗證 
1、取培養皿一個,加入酚水飽和溶液、約0.5cm高,取圓形濾紙一張,在中心剪一直徑1-2mm的小孔,并以圓心約1cm為半徑劃一圓作為底線。在此底線上,用鉛筆點四個等距離的原點并表明1,2,3,4; 
2、用毛細管分別吸取以上兩種濾液及標準谷氨酸、丙氨酸,依次點在標明號碼的原點處,以吹風機吹干,再重新點樣2-4次。注意斑點不能太大,一般直徑約0.3cm為宜。然后將濾紙平放在盛飽和酚的培養皿上。另取一條濾紙卷成筒狀,直徑約1-2mm,將此小筒插入濾紙中心小孔(不可突出紙面之上),使層析濾紙通過此小筒與酚溶液相連。另取一大小相同的培養皿蓋在濾紙上,此時酚溶液即由濾紙中心孔向四周擴散。 
3、當酚溶液擴展到距離紙邊緣約1.5cm時(約1小時),取出濾紙。用鉛筆化下酚溶液擴展邊緣,用吹風機吹干。用噴霧器噴以0.1%茚三酮溶液,再用熱風吹干。用鉛筆圈下各顯色點。測定各顯色點的Rf值,并解釋之。 
四、計算公式: 
Rf=原點至斑點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離

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