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用熒光激活的細胞分類儀檢測調亡細胞

時間:2014/9/2閱讀:1173
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1)原位缺口翻譯檢測裂解的dna 

1.取106經促調亡物質處理的細胞,用1 BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD4或抗CD8單克隆抗體,4 20分鐘。用1 BSA-PBS洗滌細胞。置冰上。 
2.加入0.1ml 1%多聚甲醛,置冰上5分鐘,加入60%(v/v)甲醇溶液,輕輕懸浮細胞,4固定細胞15分鐘。4離心500×g 10分鐘,去上清液。 
3.加入0.1ml 0.1 Triton X-100415分鐘。用1 BSA-PBS洗滌細胞2次。加入50μl缺口翻譯緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH7.45mmol/L MgCl2, 1.5U大腸桿菌DNA多聚酶I50nmol/L 生物素-14-dUTP50nmol/L dATP, 50nmol/L dGTP, 50nmol/L dCTP),37反應60分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次,懸浮于0.1ml預冷的1 BSA-PBS中。 
4.加入10μl抗生素蛋白-PE4 30分鐘,用冷PBS洗滌細胞。 
5.上樣于FACS儀,用FACScan Lysis軟件分析。可以同時了解調亡細胞的類型。 

2)末端脫氧核苷酸轉移酶檢測法檢測裂解的DNA 

1.在37,含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中,用促調亡物質喜樹堿處理人PBMC 4小時。或用105g/ml地塞米松處理小鼠胸腺細胞4小時。 
2.取106經處理的細胞,用1 BSA-PBS洗滌細胞后加入0.1ml FITC標記的抗CD或抗CD8單克隆抗體,4 20分鐘。用冷1 BSA-PBS洗滌細胞2次。置冰上,加入0.1ml 1%多聚甲醛,4 15分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次,加入冷70%(v/v)乙醇溶液,輕輕懸浮細胞,-20固定細胞24小時。4離心500×g 10分鐘,去上清液。 
3.用PBS洗滌細胞2次。加入50μl TdT反應液懸浮細胞,37反應30分鐘。用PBS洗滌細胞2次,懸浮于0.1ml PBS中。 
4.加入10μl抗生物素蛋白-TC或抗生物素蛋白-FITC,室溫反應30分鐘,用PBS洗滌細胞。 
5.上樣于FACS儀,分析調亡細胞的類型和調亡情況。 

37-AAD染色法 

1.取5×105經不同處理的細胞,用PBS洗滌細胞1次,加入10倍量PBS,離心500×g 5分鐘,去上清液。 
2.用0.5ml20μg/ml 7-ADDPBS懸浮細胞,4避光放置20分鐘。 
3.直接在FACS上用650nm濾光片檢測紅色熒光,用Lysis 軟件分析,可區分活細胞(R1)、早期調亡的細胞(R2)和后期調亡細胞/死細胞(R3)。 

4PI染色法 

1.取2.5×1053.5×105經不同處理的細胞,接種在24孔細胞培養板的各孔中,在37 5 CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2448小時。 
2.每孔加50ml 100mg/ml PI。直接在FACS上用FL2濾光片檢測紅色熒光,用Lysis 軟件分析,可區分活細胞(R1,不著染)和死細胞(R2,著染)。 

5Annexin V7-AAD(或PI)聯合染色法 

1.配制10倍濃縮的結合緩沖液:含140mmol/L NaCl, 25mmol/L CaCl20.1mol/L pH 7.0 Hepes/NaOH緩沖液,4保存,用前用雙蒸水稀釋10倍。 
2.用預冷的PBS洗滌經不同處理的待測細胞,洗2次。用結合緩沖液將細胞配制1×106/ml。取0.1ml細胞懸液置5ml培養管中。 
3.加入5μl AV-FITC,再加5μl 7-ADD10μl PI。稍稍混懸細胞,置暗處,室溫(202515分鐘。 
4.立即加入0.4ml結合緩沖液,終止反應。立即在FACS上分析。注意設立對照:未經處理的細胞對照,排除自發調亡;不加染色劑的對照;只加AV的對照;只加7-ADDPI的對照等。 

6)溴乙啶/吖啶橙染色法 

1.用細胞培養液將經不同處理的細胞配成5×106/ml。向25μl細胞懸液中加1μl溴乙啶/吖啶橙染液。室溫中染色適當時間。 
2.在熒光顯微鏡的高倍鏡下計數活細胞和有異常染色質分布的細胞。吖啶橙著染調亡的細胞核,溴乙啶染色死亡的細胞,活細胞不被染色。

 

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