材料及試劑

1. 磁性激活細胞分離器（MACS）：MACS柱（C型，可結合2×108 個細胞）生物素標記的抗CD4單抗和抗CD8單抗

2. 生物素標記的羊抗鼠IgG F(Fab)2

3. FITC標記的親和素

4. 生物素標記的磁性微珠

5. MACS柱染色洗滌液、MACS柱洗脫液（含1%牛血清白蛋白的PBS）和MACS柱

6. 浸濕液（含10%牛血清白蛋白的PBS）

7. 人懸液或淋巴細胞懸液

8. RPMI-1640細胞培養液

操作方法

1. MACS柱的準備新MACS柱需高壓滅菌，60℃烘干后備用。使用前（至少2h前）應準備完畢。將2～3個C型MACS柱內分別用10ml注射器在柱下三通閥們處加入10mlMACS柱浸濕液，使液面達到柱內鐵絲基質平面上2～3Cm處，關閉柱下三道閥們備用；

2. 將人PBMC懸液或淋巴細胞懸液（含2×10 8  個細胞）離心，重新懸浮于0.15ml MACS染色洗滌液中，加入生物素標記的CD4單抗和抗CD8單抗各25ul（比例為0.05ug/10 6 個細胞），冰浴孵育25min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min,5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入50ul生物素標記的羊抗鼠IgG F(Fab) 2 （比例為0.05ug/10 6 個細胞），冰浴孵育25min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min，5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入50ul FITC標記的親和素（比例為0.08ug/10 6 個細胞），冰浴孵育15min。用MACS染色洗滌液洗滌2次后（1500r/min,5min），重新懸浮與0.15ml MACS染色洗滌液中，加入生物素標記的磁性微珠（比例為5ul/10 8 個細胞），冰浴孵育5～10min。在加入3ml MACS柱洗脫液；

3. 將MACS柱放入MACS磁鐵槽內，用20ml MACS柱洗脫液洗柱，待液體降至柱內鐵絲基質平面上2～3處，關閉三通閥們。將細胞懸液置于MACS柱內。在柱下放一支50ml的試管，打開閥們，使其流速為3～5ml/min，邊流邊加MACS柱洗脫液，每個柱內至少加柱洗脫液30ml。試管內的洗脫液中為CD4-CD8-細胞（即陰性分離）。離心洗滌后調整細胞至所需濃度備用；

4. 將MACS柱移出磁場外，用MACS柱洗脫液洗柱（較大流速），則該洗脫液中為CD4+、CD8+或CD4+CD8+細胞（即陽性分離）。離心洗滌后調整細胞至所需濃度備用；

5. 再用另外兩個MACS柱重復上述過柱過程，以提高細胞分離純度；

6. 結果評價：分別取上述兩種細胞懸液個0.5ml，在流式細胞儀(FCM)上進行測定分析，FITC陰性細胞（陰性分離細胞）為CD4-、CD8-細胞，而FITC陽性細胞（陽性分離細胞）為CD4+、CD8+或細胞CD4+CD8+細胞。如果FITC陰性細胞中FITC陽性細胞率高于5%～10%，則需重復進行MACS分離過程。MACS分離細胞具有高純度（一般為95%～99%）等特點。其分離效果與流式細胞儀的細胞分離效果相媲美，并具有比流式細胞儀分離術經濟、省事節時、操作簡單、快速等優點。

注意事項

1. MACS柱用畢后需立即用雙蒸水沖洗干凈（或用同等柱體積量的PBS洗滌20次），再以20倍于柱體積的無菌雙蒸水和5倍于柱體積的95%乙醇溶液洗滌，37℃下烘干，高壓滅菌備用。

2. 有各種不同容量的MACS柱，可根據需要選擇。

3. 不要將組織塊或大細胞團塊加入柱內，以免造成堵塞進而毀壞MACS柱。

4. 洗脫MACS柱時，流速越慢則分離細胞的純度越高。為了獲得高純度的陰性分離的細胞群體或除去某種細胞，可重復過柱3次，*次過柱時流速可快些（6ml/min）。如果僅為了獲得陽性細胞，則流速可少快(3.5～5ml/min)。

5. 在MACS柱上加入液體時不要產生氣泡。

6. 在分離洗脫時，柱內液體不要低于柱內的鐵絲基質平面以下，即始終讓鐵絲基質內含有液體，否則細胞分離將*失敗。

7. 如果分選的細胞還需要進行培養，所有的器材和液體均應無菌。MACS分離過程應在超凈工作臺內完成操作。

8. 用作細胞功能實驗時，用免疫磁性微珠陰性分離細胞，因為這些細胞未發生抗原抗體反應而基本上處于正常狀態；而免疫磁性微珠陽性分離細胞，由于發生抗原抗體結合反應，可能導致細胞活化或凋亡，從而使細胞處于非正常狀態，影響到細胞的功能狀態。因此用免疫磁性微珠陽性分離細胞作功能實驗時應十分謹慎。