rna干擾載體主要用來研究基因表達(dá)調(diào)控，RNA干擾技術(shù)已已被廣泛用于基因結(jié)構(gòu)功能研究和傳染性疾病及基因治療領(lǐng)域，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)首先是構(gòu)建RNA干擾載體，本文以pRI系列載體為例論述了干擾載體的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程。
產(chǎn)品技術(shù)背景
pRI系列載體是基于III類rna聚合酶啟動子：人類H1啟動子的于哺乳動物細(xì)胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止信號，H1啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成人工設(shè)計的shRNA，shRNA經(jīng)過RISC剪切后形成有2個U突出末端的成熟siRNA。由于H1啟動子對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度的嚴(yán)格限制，基本上杜絕了非特異性干擾片段的產(chǎn)生，將載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對其它基因的影響降到zui低。
pRI系列載體已經(jīng)成功用于多種哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因的RNA干擾。本系列中含有新霉素抗性基因的載體用于穩(wěn)定表達(dá)sirna，可以在更長時間內(nèi)對基因表達(dá)抑制后的細(xì)胞功能和生理現(xiàn)象進(jìn)行觀察和分析。
插入寡核苷酸設(shè)計
pRI系列載體的使用需要將人工設(shè)計的寡核苷酸片段插入pRI系列載體中特定的酶切位點(diǎn)之間，寡核苷酸片段中包含了針對目標(biāo)基因的mRNA設(shè)計的長度為19nt的干擾片段。
合成時需要化學(xué)合成正向和反向兩條寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后與載體連接，插入載體XhoI，BglII位點(diǎn)之間，位于載體上H1啟動子下游正確的位置上。連接后的載體轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞在H1啟動子作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shrna。
1、選擇干擾序列。在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，RNA干擾序列的選擇會顯著影響RNA干擾效果。我們建議您按照以下幾點(diǎn)指導(dǎo)原則選擇RNA干擾序列：
² 推薦長度為19nt，采用21nt序列也可以取得良好效果。
² RNA干擾序列中不包含大于3nt的連續(xù)相同堿基。
² RNA干擾序列的GC含量為低到中等水平(推薦GC含量在35%到50%之間)。
² 不要將RNA干擾序列設(shè)計在已知的RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合位置附近。
² 確保RNA干擾序列與其它基因沒有較高的同源性。
² 方向：在編碼mRNA的正義鏈上選擇RNA干擾序列。
設(shè)計RNA干擾序列是RNAi實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。這里提供的設(shè)計原則可以為您設(shè)計RNA干擾序列提供幫助。但是，值得注意的是，遵循這些原則不能確保設(shè)計的RNA干擾序列對目標(biāo)基因有好的抑制效果。針對一個目標(biāo)基因，我們建議您至少設(shè)計3條干擾序列并且從中篩選出干擾效果好的序列。
2、寡核苷酸設(shè)計。
(1)設(shè)計正義寡核苷酸鏈(5’-3’方向)。
a) 5’TCGACCC
b) 19nt干擾序列正向序列(與目標(biāo)mRNA一致)。
c) TTCAAGAGA(環(huán)狀結(jié)構(gòu))。
d) 19nt干擾序列的反向互補(bǔ)序列。
e) TTTTT。
(2)設(shè)計反義寡核苷酸鏈(5’-3’方向)。
a) 去掉正義鏈寡核苷酸中5’TCGA
b) 將步驟a)中得到的序列做反向互補(bǔ)。
c) 在步驟b)中得到的序列的5’端加上堿基GATC。
一個設(shè)計好的例子見下圖：
實(shí)驗(yàn)流程
概述：
以下為使用pRI載體的方法概述。
1、將合成的正義和反義寡核苷酸鏈退火。
2、用BglII和XhoI雙酶切載體。
3、將退火的寡核苷酸鏈與酶切后的線性載體連接。
4、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
6、觀測熒光表達(dá)(含有GFP的載體)或篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞(含有抗性的載體)。
7、檢測目標(biāo)基因蛋白或mRNA表達(dá)水平
載體構(gòu)建
對于實(shí)驗(yàn)中的很多步驟，您可以使用您實(shí)驗(yàn)室中常用的方法，或者您的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)證實(shí)有效的方法。對于酶切、DNA純化以及轉(zhuǎn)化等步驟，您可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行，也可以參照您購買的試劑盒中生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行。
步驟1：退火寡核苷酸鏈
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，脫鹽純化的寡核苷酸足以滿足連接和克隆需要。但是不同供應(yīng)商提供的引物純度差別很大，如果您連接和克隆遇到困難，可以考慮換用PAGE純化或HPLC純化的引物，或者使用其他供應(yīng)商提供的引物。
用水將寡核苷酸稀釋為100 μM。按以下體系配制退火反應(yīng)體系：
正義寡核苷酸(100 μM) 5μl
反義寡核苷酸(100 μM) 5μl
NaCl 100 mM
Tris-Cl pH7.4 50mM
加水補(bǔ)足 50μl
將配制好的退火反應(yīng)緩沖液重復(fù)混合，短暫離心后放置PCR以上，運(yùn)行以下程序：90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20℃長期保存。
步驟2：酶切載體
用XhoI和BglII雙酶切2μg載體。酶切方法和體系參照您購買的內(nèi)切酶說明書或者按照您的實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣的方法進(jìn)行。
通常情況下用大約20-30單位的酶在大約3小時可以酶切*。
酶切后我們建議用瓊脂糖凝膠回收線性化載體。將回收后的載體體積稀釋為30μl。
對線性化的載體進(jìn)行去磷酸化處理是沒有必要的。充分酶切后的載體具有不匹配的末端，一般不會發(fā)生載體自連。
步驟3：連接載體
用水將退火后寡核苷酸稀釋100倍備用。按照以下體系配制連接反應(yīng)體系：
T4 DNA 連接酶 5U
線性化載體 2μl
稀釋后寡核苷酸 2μl
10×連接酶Buffer 1μl
加水補(bǔ)足 10μl
接連反應(yīng)條件和時間參照您購買的連接酶說明書進(jìn)行。
為了減少空載體自連，連接反應(yīng)完成后，在連接反應(yīng)體系中加入1μl BglII，37℃反應(yīng)30min，切割連接上的空載體。(選做)
步驟4：轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)
用連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。市場上常見的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(例如*0，DH5α)均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制備感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法按照供應(yīng)商的說明書或者您實(shí)驗(yàn)室中常用的方法進(jìn)行。
在氨芐抗性的瓊脂平板上37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后細(xì)菌，大約14-16小時后，平板上出現(xiàn)單個細(xì)菌菌落。挑取多個菌落至氨芐抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。
鑒定方法可以采用PCR鑒定或酶切鑒定。
PCR鑒定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)進(jìn)行鑒定，空載體擴(kuò)增產(chǎn)物長度為308bp，陽性克隆擴(kuò)增產(chǎn)物為361bp。
酶切鑒定采用HindIII和EcoRI雙酶切。空載體酶切產(chǎn)物長度為235bp，陽性克隆酶切產(chǎn)物長度為288bp。
鑒定正確的克隆可以用引物M13R-48測序驗(yàn)證插入的寡核苷酸序列是否正確無誤。
步驟5：轉(zhuǎn)染細(xì)胞
pRI系列載體可用常用的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。包括：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等。您可以購買市售的商品化轉(zhuǎn)染試劑并且參照供應(yīng)商說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
步驟6：觀測GFP熒光和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系篩選
如果細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，并且您使用了帶GFP的載體，根據(jù)細(xì)胞生長速度的不同，在轉(zhuǎn)染后3-5天能在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。請注意，綠色熒光蛋白的表達(dá)表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功，不能說明RNA干擾實(shí)驗(yàn)成功。
如果您使用了帶有真核抗性標(biāo)簽如Neo-R的載體，這時您可以加入合適濃度的相應(yīng)藥物如G418進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。
步驟7：檢測RNA干擾效率
您可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。一般情況下蛋白的表達(dá)變化與mRNA水平的表達(dá)變化一致， 也有少數(shù)情況下mRNA表達(dá)水平變化不及蛋白表達(dá)下降明顯。
為檢測蛋白表達(dá)情況，您可以使用Western-Blot。
為檢測mRNA表達(dá)情況，您可以使用逆轉(zhuǎn)錄+Realtime PCR或Northern-Blot。
具體檢測方法請參照分子克隆使用指南或者您實(shí)驗(yàn)室的常用實(shí)驗(yàn)方法。
疑難問題
遇見RNA干擾效果不理想，可以參考以下問題：1.寡核苷酸合成設(shè)計錯誤的核苷酸較多，致使序列與設(shè)計不符。建議做轉(zhuǎn)染之前對載體進(jìn)行驗(yàn)證，可以通過酶切以及測序進(jìn)行測試。2.如果細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高，建議加入GFP進(jìn)行標(biāo)記檢測。