實驗原理:植物 DNA 的抽提常采用兩種方法:
(1)SDS 法: 離子去污劑,過程長,純度高;
(2)CTAB 法:該方法簡便、快速,DNA 產量高 ( 純度稍次,適用于一般分子生物學操作 ) 。CTAB 是一種非離子去污劑,植物材料在 CTAB 的處理下,結合 65℃ 水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA 被釋放出來 。CTAB 與核酸形成復合物,此復合物在高鹽 (>0.7mM ) 濃度下可溶,并穩定存在,但在低鹽濃度 ( 0.1-0.5mM NaCl )下CTAB- 核酸復合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。經離心棄上清后,CTAB- 核酸復合物再用 70 - 75% 酒精浸泡可洗脫掉 CTAB 。再經過氯仿 / 異戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化 DNA ,zui后經異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。
實驗步驟:
1.采集適量幼嫩葉片,用液 N2 研成粉末,0.4 g 裝入 1.5ml 離心管中( -20 ℃預冷)。
2.預熱 1.5 × CTAB 到 95 ℃,加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中,混勻(防止凍融)。
3.立即置于 65 ℃水浴 30min ,每 5 min,上下顛倒 1 次。
4.12000g 離心 5 min。
5.吸取上清液約 600μl ,加入等體積( 600μl )氯仿 / 異戊醇 (24:1) ,上下顛倒數次,至下層液相呈深綠色為止。
6.12000g 離心 5 分鐘。
7.取 450μl 上清于一新 1.5ml 離心管,加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ,混勻,室溫放置 10min 。
8.12000 g 離心 10min ,去上清,用 75% EtOH 浸洗沉淀,自然干燥約 30 min 。
9.加入 50μl 1/10 TE 或無菌水(含 20μg/RNase ),置于 4 ℃過夜,待 DNA 溶解后,檢測 DNA 濃度及質量。
注意事項:
1.盡量取材幼嫩葉片,如太老,酚類物質多,必須用 10 mM 的β -ME 處理。
2.研缽預凍,粉末至加 CTAB 前不要融化。
3.24:1 的氯仿 / 異戊醇抽提時動作應輕柔,轉移用的槍頭是剪寬了的。
4.所用試劑必需滅菌,手套。
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