疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光，下文主要列舉了三種細(xì)胞免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)步驟。
 
一、zo-1的免疫熒光，步驟如下：
1.  細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。

2.  用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。

3.  4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。

4.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

5.  0.2%Triton X-100透化2-5分鐘。

6.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

7.  5%BSA室溫封閉30分鐘。

8.  加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。

9.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

10.  加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。

11.  1×PBS洗3次，每次10分鐘。

12.  95%甘油封片。

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。

二、細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：
1.  取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。

注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。

2.  4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3.  0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。

4.  與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5.  一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。

6.  二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。

7.  用DAPI染核，然后直接照熒光片。

8.  蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒桑圆挥弥讣子头獾脑挄囊凰俊?/em>

建議： 
1.  還是染完之后沒有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。

2.  熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。

3.  二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。

三、細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1.  漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。

2.  -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。

3.  PBS洗凈：3min×3。

4.  1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。

5.  PBS洗凈：2×5 min。

6.  羊血清封閉：37度，20分鐘。

7.  一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。

8.  4度PBS洗凈，3 min×5次。

9.  二抗37度小于一小時。

10.  37度 PBS洗凈，3×5 min。

11.  涼干封片（封閉液PH8.5） 
 
不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時間。