一、實(shí)驗(yàn)原理：2-DE的*向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 樣品的溶解

取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個(gè)小時(shí)。其中每隔10~15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，-80℃保存。

2. Bradford法測(cè)蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解，測(cè)定BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品蛋白含量。

取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測(cè)樣品溶液，再在每管中加入相應(yīng)體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來(lái)配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過(guò)濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測(cè)定各濃度BSA的OD值，再測(cè)樣品OD值。（測(cè)量過(guò)程要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成）。

3. 雙向電泳*向——IEF（雙向電泳中一律使用超純水）

3.1 水化液的制備

稱(chēng)取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲(chǔ)液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質(zhì)，取上清。

在含300ug 蛋白（經(jīng)驗(yàn)值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合，13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。

3.2 點(diǎn)樣，上膠

分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負(fù)極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側(cè)，再用鑷子撥開(kāi)    Immobiline  DryStrip gels （18cm，pH 3-10）膠條，從正極到負(fù)極將膠條壓入槽中，膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí)，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對(duì)應(yīng)正極，堿性端對(duì)應(yīng)負(fù)極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油（Bio-Rad），兩個(gè)上樣槽必須與底線齊平。

3.3  IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20℃）

S1 （30v, 12hr, 360vhs, step）

S2 （500v, 1hr, 500vhs, step）

S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step）

S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad）

S5 （8000v, 5hr, 40000vhs, step）       共計(jì)44110vhs, 19.5小時(shí)

其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用鑷子夾出膠條，超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過(guò)程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正（即酸性端）向下，負(fù)（即堿性端）向上，放入用來(lái)平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標(biāo)記），用平衡液A,平衡液B先后平衡15min.  注：平衡時(shí)要注意保持膠面始終向上，不能接觸平衡管壁。

平衡第二次時(shí)，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個(gè)同樣大小的小紙片，長(zhǎng)度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker,轉(zhuǎn)入SDS-PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時(shí)，煮5%的瓊脂糖10ml.

4. 雙向電泳第二向——SDS-PAGE

4.1 配膠（兩根膠條所用劑量）

分離膠：（T=8%  80 ml）：溶液于真空機(jī)中抽氣后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺儲(chǔ)液    21.28ml

分離膠buffer           20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul

雙蒸水                   38.72ml

濃縮膠：（T=4.8%   10ml）

30 % 丙烯酰胺儲(chǔ)液     1.6ml

濃縮膠buffer            2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul

雙蒸水                   5.9ml

4.2 灌膠

將玻璃板洗凈后，室溫晾干，然后，將電泳槽平衡好，玻璃板夾好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠，倒入正丁醇?jí)耗z，凝膠后（這時(shí)會(huì)出現(xiàn)三條線），用注射器吸去正丁醇，超純水洗兩次，再用濾紙除水后，倒入濃縮膠，正丁醇?jí)耗z，凝膠后，用注射器吸去正丁醇，超純水洗兩次，再加入超純水，用保險(xiǎn)膜封好。