1．常規程序
將 PCR 反應所需的成分配置完后，在 PCR 儀上于 94-96℃ 預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板 DNA 充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般 50-60℃ 之間），一般保持 30 秒鐘，使引物與模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分鐘（擴增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一個循環。重復這樣的循環 25～35 次，使擴增的 DNA 片段大量累積。zui后，在 72℃ 保持 3-7min ，使產物延伸完整， 4℃ 保存。

2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是 PCR 擴增是否順利的關鍵因素，通常在 50-60℃ 之間。具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定。延伸溫度絕大多數設定為 72℃ 。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法 PCR 。

3．反應時間
變性步驟一般使用 30 秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有 30 秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時間。

4．循環次數
循環次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為 104～105 數量級時，循環數通常為 25～35 次。
平臺效應（plateau effect）：PCR 擴增過程后期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。原因：底物和引物的濃度已經降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的穩定性或活性降低 ，產生的焦磷酸會出現末端產物抑制作用，非特異性產物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產物自身復性，高濃度擴增產物變性不*。

5．PCR 反應液的配制
pcr反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規方法與其它酶學反應一樣，在zui后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發。
對于使用具 3’-5’ 外切活性的高溫 DNA 聚合酶時，有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制，A 管含模板、引物和 dNTP ，以及調整體積的 H2O ， B 管含緩沖液、DNA 聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規的方法配制反應體系，有時會出現非特異性擴增的問題。熱啟動（hot start）PCR操作方式可較好解決這一問題。將 dNTP 、緩沖液， Mg2+和 primer 先配制好，然后加入一粒蠟珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，zui后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有當 PCR 反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。