為了獲得大量的AKP基因，我們需要將目的基因通過pcr擴(kuò)增基因劑量，方便下一步實(shí)驗(yàn)作基因重組。

我們需要注意PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和產(chǎn)率。特別注意引物、復(fù)性溫度、taqE對(duì)準(zhǔn)確性的影響和延伸時(shí)間（1000bp/min）、Mg2+濃度、循環(huán)數(shù)（小于等于30）對(duì)產(chǎn)率的影響。

同時(shí)，我們要掌握PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。

實(shí)驗(yàn)原理及過程

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)原理

1 PCR體系的準(zhǔn)備和PCR擴(kuò)增的開始

2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL

10xbuffer Mg2+ Ex－TaqE ddH2O 40uL

primer 4uL

模板DNA 2uL

940C,2’ 940C 1’ 420C 1’ 720C 2’ 720C 10’ I-------30cycles----I

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技術(shù)。

在合適條件下，這種循環(huán)不斷重復(fù)，前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可作為后一循環(huán)的模板參與DNA的合成，zui終使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增。

理論上講經(jīng)過30次的循環(huán)反應(yīng)，DNA擴(kuò)增倍數(shù)為106-109。

PCR引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，3’端要嚴(yán)格配對(duì)，5’可以引入酶切位點(diǎn)，也可以由此控制Tm值和CG的比值。

TaqE有zui適溫度和反應(yīng)的活性，要注意它有加尾活性。

循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，因?yàn)楫a(chǎn)物數(shù)量增加和反應(yīng)物數(shù)量的減少，反應(yīng)速度降低，這時(shí)對(duì)反映的產(chǎn)率已經(jīng)沒有貢獻(xiàn)，反而副產(chǎn)物增多,影響效果。所以，循環(huán)數(shù)不應(yīng)超過30。

2 PCR產(chǎn)物電泳

0.8 %Agarose（1×TAE） 80伏恒壓電泳

全部PCR產(chǎn)物上樣電泳：

6uL 10xloading

6uL SYBR

marker部分：

10uL marker（含loading buffer）

1uL SYBR

因?yàn)镻CR產(chǎn)物會(huì)有一些副產(chǎn)物，所以要用電泳的方法分離各種PCR產(chǎn)物。這樣也能分離TaqE等雜質(zhì)。

為了分辨PCR產(chǎn)物和PCR副產(chǎn)品，需要跑一個(gè)分子量marker，我們的產(chǎn)物是1.6kp。

用TAE的原因是高嚴(yán)可以降低Agarose熔點(diǎn)，促進(jìn)之后的DNA 吸附。

3 PCR產(chǎn)物的回收（玻璃奶吸附法）

1)

紫外燈下切膠，稱膠重

SYBR會(huì)使DNA部分顯出綠色熒光，在紫外燈下辨認(rèn)綠色熒光，可將膠切下。

2)

每100mg膠加入300 uL溶膠液，50 oC溶膠

讓DNA充分釋放到液體中。

3)

將在-20 oC凍存的玻璃奶解凍，振勻！！

玻璃奶為細(xì)微的玻璃小顆粒，因酷似奶狀而得名。它為懸濁液，而可以起吸附作用的小顆粒會(huì)沉降下來，所以，只有搖勻，我們才能渠道足量的玻璃小顆粒，完成分離的過程。

4)

在溶解后的膠液中加入10 uL玻璃奶，吹打均勻，冰浴沉淀10min， 10,000rpm離心1min，去上清。

這是一個(gè)類似于吸附層析的過程。DNA會(huì)特異的吸附于玻璃奶的小顆粒上，而膠不會(huì)吸附于其上，故可以起到分離的效果。

高鹽能促進(jìn)吸附。

5)

在離心所得沉淀中加入200 uL稀釋濃縮洗膠液（3體積濃縮洗膠液加入7體積無水乙醇即得稀釋液），吹打均勻，10,000rpm離心1min，去上清，如此洗兩次。

這是一個(gè)洗滌的過程。

6)

50 0C干燥。

7)

加入20 uL TE，吹打均勻，60 oC 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清為回收的PCR產(chǎn)物，-20oC保存。

此步驟是解析。

讓DNA釋放到溶液中，李新的方法可以將DNA純化。

低鹽有利于解吸附。

8)

檢測(cè)是否含有DNA

取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外燈下觀察，若有綠色熒光，則證明有DNA存在。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
本次試驗(yàn)中，在zui后一步檢測(cè)中看到了熒光，說明了DNA的存在，證明回收到了PCR的產(chǎn)物。