實驗目的:了解掌握檢測DNA 質量的方法以及DNA定量的方法;了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素;訓練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性內切酶操作。
實驗原理:參見系列一中實驗二;限制性內切酶的特點:見“基因操作原理”。
實驗材料及試劑:水稻總DNA或BAC克隆DNA,瓊脂糖,限制性內切酶DraI,EcoRI,EcoRV,HindIII
實驗步驟:
1.取10µl DNA于0.8% 凝膠檢測;
2.將DNA調節濃度至300-400 ng/µl ;
2.仔細閱讀將所用的任何一種酶產品說明書,熟悉反應條件及酶切的貯存濃度(10U-50U/µl)廠家配套試劑;
3.計算據反應條件所需要的各種試劑準確用量:(0.5 ml tube中)
DNA(3-5µg) 10µl
10´ buffer reaction 1.5µl
enzyme (15 U/µl) 0.8µl(冰上)
ddH2O 2.7µl
混勻,短暫離心;
4.37℃ 溫浴1-2 hrs (純DNA) 或10 hrs(粗制DNA);
5.加入上樣緩沖液終止酶切反應,也可65℃加熱10 min使酶變性失活;
6.電泳檢測酶切效率:
每個樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測,制膠及點樣方法同上。
結果分析
若水稻DNA呈現均勻連續分布的一片,則酶切效果好,否則需重做;
DNA被切爛:DNA降解,重新提DNA;
DNA切不動:雜質多(多糖,蛋白質,酚類,有機溶劑等),重新純化;
若是BAC克隆DNA,酶切后應出現多條很清晰的不同大小DNA帶。
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