引言

對DNA片段在按特殊要求進行修飾上PCR技術提供了一種比原有技術更快更簡單的 方法。因為與重組DNA技術相比，PCR技術本身就較為簡單;而且它還可以通過化學合 成寡聚核苷酸引物的方法更為簡便地改變DNA的堿基序列，而不需對DNA片段進行限制 性內切酶和連接酶操作;再者，PCR技術還可能很方便地進行序列改造，如在引物5"端 加上一個“添加”序列(add-on sequences)。此外PCR技術產生的修飾產物效率幾乎 可達100%。

Scaharf等人首先提出PCR技術可以很方便地將酶切位點導入DNA片段中，這只需 將這些序列加到寡核苷酸引物的5"-末端上。雖然這些序列與模板DNA是不朽對的，但 在大多數情況下，它們幾乎不影響擴增的特異性和擴增效率;特異性顯然是由內引物 的3"-末端決定的。當帶有這些“添加”引物的DNA鏈進行在我復制時，這些添加的內 切酶位點序列也就“安裝”到由此而擴增出的PCR片段中，目前已有人報道長達45個 堿基的添加序列。

通過PCR引物引入DNA序列變異的原理是非常有用的。zui為簡便的是它可以使PCR 產物的一條鏈或另一條鏈或兩條鏈都特異性地標記上放射同位素、生物素或熒光素。 它還可以在DNA序列的任一位置上進行改變，或用來在任何所需的連接點進行DNA序列 的重組。本章主要就是討論這些步驟。

用引物標記PCR產物

用γ-32P-ATP直接將一個PCR引物磷酸化(Kinasing reaction)，然后在標準PCR 反應中直接使用標記的引物來擴增出一端帶有標記的片段。將這種末端標記法應用到 通過Maxam-Gilbert或磷酸硫代化學法對產物進行直接測序，以及合成一些適用于進 行蛋白質的結合/保護分析(binding/protection assays)或“足跡法”的DNA序列。PC R技術是一種在體外合成用于蛋白“足跡法”分析所需DNA片段的簡便方法。蛋白“足 跡法”分析不依賴限制性內切酶位點并且比限制性內切酶位點并且比限制性內切酶片 段的分離和末端標記更為簡便。

生物素可以標記到一個寡核苷酸引物的5"-末端上，其結果并不影響PRC反應。這 為用抗生蛋白鏈菌素─或抗生物素蛋白─酶共扼物檢測雜交PCR產物提供了一個非同 位素法，它還可以用抗生蛋白鏈菌素柱(Streptavidin─columns)將產物的一條鏈與 另一條鏈分開;此外，它還可以對PCR產物進行定量。同樣，也可制備用熒光標記的寡 聚物并應用在PCR技術中。帶有不同熒光標記的特異性引物可以區分從不同位點擴出 來的PCR產物。

在PCR產物的末端導入有用序列

如圖1所示，內切酶的識別位點可被加到單個或兩上PCR引物的5"端上。這些位點 有助于擴增片段插入到克隆載體中。在擴增產物的兩端加上不同的酶切位點，產生的 特異性的粘性末端就可直接進行克隆轉化。在設計“添加”內切酶位點的序列時，zui 好在標準識別序列的5"末端另外再多加幾個堿基，以免處于片段zui末端的酶切位點可 能不被內切酶所識別。文后的操作指南A就是關于將PCR產物的這種位點上進行酶切， 并用連接酶將產物插入克隆載體的操作步驟。用這種方法加到PCR片段的其他序列還 有RNA聚合酶的啟動子。這些富含G+C序列是為了增強變性梯度凝膠電泳的分辯力，以 使它能區別出單堿基差異的不同片段。

由PCR產生的突變和重組

Mullis等指出PCR技術可以用來“裝配”重疊寡核苷酸使之成為很長很長的PCR產 物，從而獲得比用直接化學合成法具有更多產量的全合成DNA模板的兩年PCR產物準確 地連接起來。如圖二所示，從同一模板的不同區域擴增出來的兩個PCR產物，經過這 樣處理后，得到的片段在序列上能相互重疊。這些產物可經過混合，變性及退火。在 異源雙鏈中有一條鏈在3"-末端發生重疊，利用與其5"-末端配對的引物，來擴增這個 異源雜合雙鏈，我們就可以從由兩上次級PCR產物準確地連接成的片段混合物中調出 一個片段(按Mullis的說法)。由于特生的擴增，PCR反應中的絕大多數產物是我們所 需的重組DNA片段。

通過引物導入的序列變異因化學合成的引物長度有限而受到限制，但此法與PCR 片段連接法組合使用，可在片段的任一位置引入變異，而不僅僅是在其末端引入。重 組所需的重疊序列不必存在于天然模板，可設計成添加序列進入引物。這樣，通過 PCR技術幾乎可在DNA片段任何位置上特異性地進行位點替代、缺失和插入，同時它還 可以將本來毫不相關的序列準確地連接起來。