一、原理與意義
通過抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對樣品中的抗原或抗體進行定性和定量檢測。本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法,用抗小鼠TNF-a單抗包被于酶標板上,標準品和樣品中的TNF-a與單抗結(jié)合,加入*化的抗小鼠TNF-a抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin)與*結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺(OPD),出現(xiàn)黃色,加終止液濃硫酸,顏色變深,在492nm處測OD值,TNF-a濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中TNF-a濃度。它是樣品中蛋白質(zhì)含量檢測的定性和定量方法。
二、試劑盒的組成
96/48微孔板(1塊,已包被抗小鼠TNF-a單抗)、樣品稀釋液(1瓶)、*抗體工作液(1瓶)、酶標抗體工作液(1瓶)、底物稀釋液(1瓶)、終止液(1瓶)、洗滌液(20×,1瓶)、標準品(2000 pg/ml,2管,凍干粉)、OPD片(3片)、坐標紙(1張)。
四、操作步驟
1、設(shè)立標準孔8孔(根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6孔),每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,*孔再加標準品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔,zui后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul。第8孔為空白對照。
2、加樣:待測樣品孔中每孔各加入待測樣品100ul。
3、將反應(yīng)板置于37 ℃×120 min。
4、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次,向濾紙上扣干。
5、每孔中加入*抗體工作液50ul。
6、將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃×60 min。
7、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向濾紙上扣干。
8、每孔加酶標抗體工作液100ul。
9、將反應(yīng)板置于37 ℃ 120 min。
10、洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4~6次,向濾紙上扣干。
11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗處反應(yīng)5~10 min。
12、每孔中加入50ul終止液混勻。
13、用酶標儀在492 nm處測吸光值。
