細胞：MPC-5細胞

中文名稱：小鼠足細胞

生長特性：貼壁

培養(yǎng)基：1640 培養(yǎng)基  血清：10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO

收到細胞后請盡快更換配套培養(yǎng)基，或自己配置的新鮮培養(yǎng)基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基，請在原瓶培養(yǎng)基中額外添加10%的血清（原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時間最長不宜超過72小時）。

MPC-5細胞傳代：

1）：細胞密度約80%時，吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤洗細胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進行消化細胞（注意根據(jù)實際情況，把握消化時間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細胞邊緣縮小，貼壁松動時；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細胞層某處，即可肉眼可見細胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續(xù)消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞層，把細胞層吹落，吹散。

3）：取部分細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，添加適當?shù)呐囵B(yǎng)基，把細胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4）：注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細胞密度達到80%以后重復1項操作或者凍存。

（網(wǎng)絡信息主針對網(wǎng)絡推廣作用，僅供參考，細胞培養(yǎng)請咨詢細胞庫管理員，以細胞庫管理員提供給您的信息為準，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細胞庫管理員，避免不必要的損失；）

古典豬瘟病毒(CSFV)核酸擴增檢測RNA提取

樣品處理:    

1):固體組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents），研磨或振蕩，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，室溫放置5min。

血清樣品或病毒液：取100 μl釋出血清或病毒液加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。

2):加入100μl氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4℃ 13,000rpm離心5min。

3):小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300 μl 無水乙醇，另加10μl RNA提取液B（內(nèi)含不溶物，使用前室溫溶解并充分混勻），充分混勻，13,000rpm離心1min。

4):棄上清，加入500 μl 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13,000rpm離心1min，小心吸去大部分乙醇。

5):將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20µl DEPC H2O溶解沉淀。

陰性質(zhì)控品：取100μl陰性質(zhì)控品加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，后按1.2~1.5操作。

CSFV陽性質(zhì)控品：直接取3μl進行PCR擴增。

結(jié)果分析判定：

反應結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct 值在40以上，Ct值小于38個循環(huán)的為陽性；Ct值在38-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進行重復試驗。重復試驗之后，如果Ct值仍然在38-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。

【質(zhì)控標準】

陰性質(zhì)控品：沒有熒光值增長，全部陰性。

CSFV-陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品的 Ct值均應小于30.0。

以上條件應同時滿足 ，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。