人胚肺成纖維細胞MRC-5 細胞 RNA提取實驗方法流程
1、實驗目的
提取人體細胞的總RNA和mRNA。
2、本實驗所需試劑
1）、CNE-2細胞及培養細胞的一系列條件，
2）、PBS緩沖液， TRIZOL試劑，
3）、DEPC處理過的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4）、新的氯仿、異丙醇和乙醇，
5）、mRNA分離試劑盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的電泳緩沖液，專跑RNA的瓊脂糖（Agarose）。
人胚肺成纖維細胞MRC-5 細胞 RNA提取實驗方法流程3、實驗流程（掌握內容）
3.1 細胞總RNA的提取
1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml，搖勻，無菌罩內消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠，細胞脫壁）。
2）、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中，加新開的氯仿0.2 ml，輕搖15秒。
3）、室溫靜置2-3分鐘后，12000 rpm，15 min，4℃，離心。然后取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。
4）、12000 rpm，10分鐘，4℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清（小心別丟了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃離心。
5）、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘， DEPC處理水20-30 ul加入，中槍打勻，55-人胚肺成纖維細胞MRC-5 細胞 RNA提取實驗方法流程60℃水浴10分鐘溶解總RNA，測OD值。
6）、電泳。
3.2 從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少于0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打勻或用手彈勻。
3）、70℃水浴，3分鐘（裂解RNA的二級結構）。
4）、20-30℃條件下，靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結合）。
5）、高速離心2分鐘，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 ul的上清在原管里。
6）、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉淀，然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。
7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過液。
8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 ul熱的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘。
9）、為保證zui大的 mRNA產量，可再次重復第8步。
10）、電泳。
4、mRNA的應用（了解內容）：
RT-PCR, Northern雜交，cDNA文庫構建, mRNA末端快速擴增（RACE），差異表達（DDRT-PCR），引物延伸反應（Primer Extension），體外轉錄（In Vitro RNA Transcription）, RNA標記（RNA labeling），RNA酶保護試驗（RNase and S1 Nuclease Protection Assay），RNA微注射（RNA Microinjection）
人胚肺成纖維細胞MRC-5
人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1
人胚胎氣管組織來源細胞CCC-HBE-2
人胚胎肺成纖維細胞WI-38
SV-40Z轉化肺成纖維細胞WI38/VA13
人胚肺二倍體細胞2BS
人胚肺二倍體細胞KMB-17
人肺細胞HLF-a
人小細胞肺癌細胞DMS 153
人胚肺細胞 VA13細胞WI-38 VA13亞系 2RA
人胚肺二倍體細胞HEL-1
人胚肺細胞系KuMA
人肺轉化細胞系AE1201
人肺鱗癌細胞NCI-H226
人胚肺二倍體細胞HEL-2
人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B
人胚肺轉化細胞SL-1
人肺腺癌細胞Calu-3
人小細胞肺癌細胞NCI-H209
人低分化肺腺癌細胞GLC-82
人小細胞肺癌細胞NCI-H446
人非小細胞肺腺癌細胞NCI-H157
人肺鱗癌細胞NCI-H520
人肺巨細胞癌高轉移細胞株PG-BE1
人肺巨細胞癌低轉移細胞株PG-LH
