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聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA 段的方法，在微生物感染的診斷中具有重要的價值。在PCR擴增過程中，擴增的DNA產量是呈指數上升的，經過n個循環的擴增，一個DNA分子的產量便達到2n個拷貝。PCR產物一般為1013拷貝/ml，取0.1ml即為109拷貝，而1mg人基因組DNA才含1.4´106拷貝的單拷貝基因片段，因此使得PCR擴增反應具有強大的擴增能力，提高了檢測的敏感性。此外，利用PCR反應，還能夠對感染因子實施定量分析，實時監測其在宿主體內的動態變化，有利于指導臨床診療。正是由于PCR反應具有強大的擴增效率，也導致其易污染的缺點，極微量的污染便可導致假陽性結果。
ATCC細胞傳代細胞現貨銷售中PCR反應中，主要存在三個污染源：
1、標本間的交叉污染。
2、實驗室克隆質粒的污染。
3、PCR擴增產物的污染。
其中以第三個污染源zui主要，通過下面一個例子便可認識到PCR產物污染的嚴重性。在100ml的反應管中可產生1012拷貝個分子，若將這些分子在一個標準奧林匹克游泳池（50m´25 m ´2m）內稀釋后，0.1 ml稀釋液含有400拷貝的擴增分子，遠遠超過了PCR擴增反應檢測數個拷貝的極限。因此，PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘留污染的問題，對臨床實驗室尤應如此。本文就PCR污染的預防、污染源的追蹤及污染的處理進行分析。
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一、污染的預防
進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，zui大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
（一）劃分操作區
目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現*閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：
1、標本處理區，包括擴增摸板的制備。
2、PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增。
3、產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
（二）分裝試劑 PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
1、PCR用水應為高壓的雙蒸水。
2、引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制。
3、引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
（三）實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
2、使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
3、避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的度。
5、zui后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。
6、操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
7、盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
8、重復實驗，驗證結果，慎下結論。
二、追蹤污染源
如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。
（一）設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性*，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。
