傳代細(xì)胞 組織細(xì)胞的培養(yǎng)
體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:
一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)
上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞,并難以純化,同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存,因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。
體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜,因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng),另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)時(shí),細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2 含量和溫度,向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子,均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。
以表皮細(xì)胞為例,用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)
1、取材:外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。
2、置0.02?A中,室溫,5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過(guò)。
4、傳代細(xì)胞 組織細(xì)胞的培養(yǎng)分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與層分開(kāi)。
5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30-60分鐘。
6、反復(fù)吹打,制成懸液。
7、培養(yǎng):用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后,低速離心,吸去上清。
8、直接加入培養(yǎng)基(Eagle加20%小牛血清)制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)瓶,CO2溫箱培養(yǎng)。
二、傳代細(xì)胞 組織細(xì)胞的培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞,對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子(TAF)等有很大價(jià)值。
研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡(jiǎn)便,其法如下:
1、產(chǎn)后新鮮臍帶,無(wú)菌剪取10―15厘米長(zhǎng)一段,如不能立即培養(yǎng),可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3-10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復(fù))。
5、離心去上清,加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)器皿中,置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。