菌種的保藏方法

目的
1、了解各種保藏方法的優缺點及其適用的目標微生物。
2、學習并掌握幾種常用的微生物菌種保藏方法。
原理
保藏微生物菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身，而且還必須要盡可能地使菌株的遺傳性狀保持不變，同時保證其在整個保存過程中不被他種微生物污染。因此，選擇一種能夠長期有效且穩定的保藏微生物菌種的方法事關重要。
由于微生物種類繁多，且保存方法的難易程度不同，所以微生物菌種的保藏方法亦有許多。但是不管有多少種菌種保藏方法，其基本原理都要求使微生物的代謝作用降至zui低程度，從而使其處于不活潑的狀態，即休眠狀態。就微生物本身而言，保藏就是要利用它們處于休眠狀態的孢子或芽孢而進行；而從環境條件來說，就是要選用低溫、干燥和缺氧等三個條件。以下將對幾種微生物菌種的保藏方法加以簡單介紹。
1、傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存，它是zui基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。
傳代保存時，培養基的濃度不宜過高，營養成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于zui適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。
一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。
傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經常容易發霉；②菌株的遺傳性狀容易發生變異；③反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種，工作量大；⑤雜菌的污染機會較多。
2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點，同時也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產孢能力低的絲狀菌）的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進行保存。
3、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如
① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基（以含水量為土壤zui大持水量的60%為宜），然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存。
② 砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經干熱滅菌后，加入1ml菌種培養液，經充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經HCl預處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保藏。
③ 硅膠保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。
④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經干熱滅菌后，接入菌懸液，zui后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。
⑤ 麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水，經滅菌后接種培養，zui后干燥保藏。
⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內進行保存。
4、懸液保存法：即使微生物混懸于適當溶液中進行保存的方法。常用的有，
① 蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。
② 糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點，

 淺灰鏈霉菌杭州變種
 刺孢吸水鏈霉菌北京變種
 吸水鏈霉菌應城變種
 諾爾斯氏鏈霉菌
 涇陽鏈霉菌
 吸水鏈霉菌奧薩霉素亞種
 登佐鏈霉菌
 抗輻射鏈霉菌
 珊瑚鏈霉菌
 昆明鏈霉菌
 菲律賓鏈霉菌
 沙鏈霉菌
 絲狀鏈霉菌
 抗生鏈霉菌
  
 粗糙脈孢菌
 北京棒桿菌
  
  
 煙酸芽孢桿菌
 綠針假單胞菌
 副溶血性弧菌
 腐敗希瓦氏菌
  
 產氣莢膜梭菌
 食油假單胞菌
 弗氏檸檬酸桿菌
 多黏類芽孢桿菌
 嗜熱脂肪芽孢桿菌
  
 單增李斯特菌
  
 
 
 蒼白芽孢桿菌
 土壤伯克氏菌
 變異鏈球菌
 短乳桿菌
  
  
 環狀芽孢桿菌
 蠟蚧輪枝孢菌
 納地青霉
 焦曲霉
 棉花立枯菌
 白色假絲酵母
  
 谷氨酸棒桿菌
 阪崎腸桿菌
 清酒乳桿菌清酒亞種
 大豆慢生根瘤菌
  
 樹狀微桿菌
 蛾微桿菌
 青春雙歧桿菌 
 人蒼白桿菌

① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；
② 要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異；
③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；
④ 在菌液內不添加電解質（如食鹽等）；
⑤ 可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。
⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
⑦ 就動物細胞而言，應在－20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在－35℃范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；
⑧ 若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；
⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。