人NK 細(xì)胞克隆的制備
基本原理
NK 細(xì)胞克隆來源于NK 細(xì)胞，該細(xì)胞的分離方法參見*節(jié)之四。這些NK 細(xì)胞與經(jīng)γ射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞苓而獲得的NK 細(xì)胞克隆。
試劑和材料
● 植物血凝素（PHA）母液為100μg/ml
● 重組IL－2（rIL－2）母液為105u/ml，分裝小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃長期保存，或置4℃下短期存放。應(yīng)避免反復(fù)凍融，IL－2 不能用濾器過濾除菌處理。
● 培養(yǎng)基
1.接種培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
2.飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
3.NK 克隆培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉，經(jīng)0．2u 濾板過濾再加入100u/ml IL－2。
4.培養(yǎng)液：RPMI1640＋10％FCS。
● 飼養(yǎng)細(xì)胞：自體或同種異體PBMC
● 器皿和儀器：96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、多頭移液管、微量移液管、倒置顯微鏡、CO2 孵箱、低溫離心機(jī)、垂直氣流超凈臺
實(shí)驗(yàn)操作
1.NK 細(xì)胞的制備
1） 制備NK 的方法參見*章之第四節(jié)。
2） 懸浮NK 于接種培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至106/ml。
2.接種NK 細(xì)胞
1） 制備飼養(yǎng)細(xì)胞（PBMC）方法參見*章*節(jié)。
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS 153
人胚肺細(xì)胞 VA13細(xì)胞WI-38 VA13亞系 2RA
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-1
人胚肺細(xì)胞系KuMA
人肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞系A(chǔ)E1201
人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H226
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-2
人支氣管上皮樣細(xì)胞BEAS-2B
人胚肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞SL-1
人肺腺癌細(xì)胞Calu-3
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H209
人低分化肺腺癌細(xì)胞GLC-82
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H157
人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H520
人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)G-BE1
人肺巨細(xì)胞癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)G-LH7
人肺癌細(xì)胞A-427
人低分化肺腺癌細(xì)胞SK-LU-1
人肺支氣管癌細(xì)胞NCI-H1650
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H2087
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H2227
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H23
人肺腺鱗癌細(xì)胞NCI-H596
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H838
2） 于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min。
3） 被離心的飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于飼養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。
4） 用強(qiáng)度5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞，于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，將離心細(xì)胞再懸浮于飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，飼養(yǎng)細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。
5） 在6 塊96 孔培養(yǎng)板的各孔中加100μl 上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（總量用60ml 飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，含1．2×108 個飼養(yǎng)細(xì)胞）。
6） 將96 孔板置37℃孵箱預(yù)溫，直到加入NK 細(xì)胞。
7） 將NK 細(xì)胞懸浮于接種培養(yǎng)液中，并于預(yù)溫的96 孔板中加入100μlNK 細(xì)胞，使成為10 細(xì)胞/孔、5 細(xì)胞/孔和2．5 細(xì)胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復(fù)二塊板。
8） 將培養(yǎng)板置5％CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)。
3.NK 細(xì)胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞）
1） 從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有經(jīng)照射的飼養(yǎng)細(xì)胞（2×106 細(xì)胞/ml）的NK 克隆培養(yǎng)液100μl。此培養(yǎng)液的制備方法如下：
（1） 融化飼養(yǎng)細(xì)胞，移至50ml 試管中。
（2） 輕輕地加入培養(yǎng)液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞。
（3） 用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，并計(jì)數(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。
（4） 按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于NK 克隆培養(yǎng)液中，調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106/ml。
4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養(yǎng)液100μl。
5.檢測NK 細(xì)胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細(xì)胞生長，按第8 天的操作換液。
6.分離克隆（11－15 天）
1） 當(dāng)培養(yǎng)液顏色變黃時，證明細(xì)胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養(yǎng)。
2） 在96 孔板上擴(kuò)增克隆，并重復(fù)第7 天的操作。
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H125
人肺癌細(xì)胞H1299
人肺癌細(xì)胞TKB-1
人肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2
人肺腺癌細(xì)胞Lu-165
人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460
人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1
人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞095-D
人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1
人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H661
人肺黏液上皮樣癌細(xì)胞NCI-H292
人肺退行性癌細(xì)胞Calu-6
人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H358
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827
人典型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1688
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299
人胚肺二倍體細(xì)胞2BS
人支氣管上皮樣細(xì)胞BEAS-2B
人胚肺成纖維細(xì)胞CCC-HPF-1
人胚胎氣管組織來源細(xì)胞CCC-HBE-2
人肺腺癌細(xì)胞Calu-3
人肺退行性癌細(xì)胞Calu-6
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS 153
人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D
人低分化肺腺癌細(xì)胞GLC-82
人肺細(xì)胞HLF-a
質(zhì)控與提示
1.每天需檢查細(xì)胞生長情況。
2.NK 細(xì)胞克隆只生長在96 孔板上，NK 細(xì)胞總是用96 孔培養(yǎng)板進(jìn)行克隆培養(yǎng)。
3.目前了解，鼠NK 細(xì)胞克隆的制備于短期培養(yǎng)。
