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斑馬魚睪酮（T）ELISA試劑盒操作方法

閱讀：237發(fā)布時間：2014-01-08

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斑馬魚睪酮(T)ELISA試劑盒操作方法

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：                                                          96T

0.4nmol/L - 12nmol/L

 

使用目的：

本試劑盒用于測定斑馬魚血清、血漿及相關(guān)液體樣本中睪酮(T)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中斑馬魚睪酮(T)水平。用純化的斑馬魚睪酮(T)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入睪酮(T)，再與HRP標記的睪酮(T)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的睪酮(T)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中斑馬魚睪酮(T)濃度。

試劑盒組成

1

30倍濃縮洗滌液

20ml×1瓶

7

終止液

6ml×1瓶

2

酶標試劑

6ml×1瓶

8

標準品（24nmol/L）

0.5ml×1瓶

3

酶標包被板

12孔×8條

9

標準品稀釋液

1.5ml×1瓶

4

樣品稀釋液

6ml×1瓶

10

說明書

1份

5

顯色劑A液

6ml×1瓶

11

封板膜

2張 

6

顯色劑B液

6ml×1/瓶

12

密封袋

1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

  1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

12nmol/L

5號標準品

150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

6nmol/L

4號標準品

150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

3nmol/L

3號標準品

150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

1.5nmol/L

2號標準品

150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

0.75 nmol/L

1號標準品

150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

 

 

  1. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
  2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  
  3. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
  4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
  5. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
  6. 溫育：操作同3。
  7. 洗滌：操作同5。
  8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
  9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
  10. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

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