細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

中文名稱：HIV-1抑制劑(Oleanonic acid)

英文名稱：Oleanonic acid

產品規格：1mL(10mM)|50mg

產品貨號：BJ-01X8609

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

人 EMR2 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽載玻片細胞CASPASE-3蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 KIR3DS1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽冰凍切片組織CASPASE-3蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 SLAMF6 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽石蠟切片組織CASPASE-3蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 STK19 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞CASPASE-3蛋白表達比色法定量檢測試劑盒  10/50 次

人 CEACAM7 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞CASPASE-3蛋白表達熒光定量檢測試劑盒  10/50 次

人 ANP32A 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽CASPASE-3蛋白表達西方雜交分析試劑盒  5次

人 IFNA6 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽CASPASE-3蛋白免疫共沉淀分析試劑盒  5次

人 CLC 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽CASPASE-3蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒  25次

人 IL17B 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽細胞CASPASE-4蛋白表達流式細胞儀檢測試劑盒  10/20次

人 PLXNB1 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽載玻片細胞CASPASE-4蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 TNFRSF13B 基因全長ORF克隆 (表達載體), 無標簽冰凍切片組織CASPASE-4蛋白表達熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

HIV-1抑制劑(Oleanonic acid)Rabbit Anti-rat IgG/Cy3  Cy3標記的兔抗大鼠IgG 規格: 0.1ml

OST-beta  有機溶質轉運蛋白OSTβ抗體 0.2ml

Cathepsin H/CTSH  組織蛋白H抗體 規格: 0.1ml

PDE4D  磷酸二酯4D抗體 規格: 0.1ml

CD168/RHAMM  透明質酸介導細胞游走受體抗體 0.2ml

Phospho-MSK1 (Ser212)  磷酸化有絲分裂原和應激活化型蛋白激1抗體 規格: 0.1ml

RIP5/RIPK5  受體結合絲蘇激5抗體 規格: 0.2mlCrkRS/CRK7  細胞分裂周期2相關蛋白激7抗體 規格: 0.2ml

TASK 3/KCNK9  酸敏性鉀離子通道蛋白抗體 0.2ml

Mouse Anti-human IgG(3D3)/Cy5  Cy5標記的鼠抗人IgG單克隆抗體 規格: 0.1mlSkp2/skp2 p45  細胞S期激相關蛋白2抗體 規格: 0.1ml

DARPP32  多巴胺、cAMP調節磷蛋白抗體 規格: 0.2mlMLCK  肌球蛋白輕鏈激抗體 0.1ml

AAT1/C3orf15  3號染色體開放閱讀框15抗體 規格: 0.2mlNCX2/SLC8A2  鈉鈣交換蛋白2抗體 規格: 0.1ml