細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)

英文名稱：T56-LIMKi

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8521

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

大鼠 IL27 基因全長(zhǎng)ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  10次

大鼠 IL21 基因全長(zhǎng)ORF克隆（SCHMORL）間接染色試劑盒  

大鼠 IL8RB 基因全長(zhǎng)ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素鐵還原法  50次

大鼠 IL4R 基因全長(zhǎng)ORF克隆（SCHMORL）直接染色試劑盒  

大鼠 IL2RG 基因全長(zhǎng)ORF克隆細(xì)胞衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL1R2 基因全長(zhǎng)ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL25 基因全長(zhǎng)ORF克隆全組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

大鼠 IL19 基因全長(zhǎng)ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 TNFRSF18 基因全長(zhǎng)ORF克隆冰凍切片組織衰老晚期特異性脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  50次

大鼠 IL18R1 基因全長(zhǎng)ORF克隆品紅亞硫酸鹽（FUCHSIN SULFITE）原位染色試劑盒  

大鼠 IL17RA 基因全長(zhǎng)ORF克隆石蠟切片組織衰老特異性晚期脂褐素高碘酸希爾（PAS）法  10次

LIMK2抑制劑(T56-LIMKi)MYCBP2  MYC結(jié)合蛋白2抗體 規(guī)格: 0.2ml

PNPT1  多核苷酸磷酸化蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

FOXO3A  叉蛋白O3A抗體 規(guī)格: 0.2mlphospho-MAX protein(Tyr123)  磷酸化Myc基因相關(guān)X因子抗體 規(guī)格: 0.1ml

PDHB  丙酮酸脫E1β亞單位抗體 規(guī)格: 0.2ml

C12ORF61  12號(hào)染色體開放閱讀框61抗體 規(guī)格: 0.2mlM2-PK/PKM2  小鼠抗丙酮酸激-M2抗體 規(guī)格: 0.1ml

Histone H3 (Di Methyl K27)  三甲基化組蛋白H3抗體 規(guī)格: 0.1ml

SMAD9  SMAD家族9抗體 規(guī)格: 0.2ml

AP2M1/AP-2?  接相關(guān)蛋白復(fù)合體AP-2μ鏈1抗體 規(guī)格: 0.2mlGTSE-1  G2期/S期應(yīng)答相關(guān)蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-Guinea pig IgG/Bio  標(biāo)記的小鼠抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1ml

RAB40B  RAS基因家族蛋白R(shí)AB40B抗體 規(guī)格: 0.2ml

CRMP4/DRP3  腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白4抗體 規(guī)格: 0.2ml