Human IFN ELISpot
Human IFN-γ ELISpot操作指導
A. 準備和預包被板的封閉（無菌操作）
1． 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板，用無菌PBS洗4次（200?l/孔）。
2． 用10%血清的*培養基封閉（200?l/孔），室溫孵育30分鐘。
B. 細胞的孵育（無菌操作）
1． 倒掉培養基，加入細胞懸液并加入刺激因子，如抗原（終體積100-150?l/孔）。用mAb CD3-2 為陽性對照。
2． 把板子放到37℃ 5%CO2培養箱孵育12-48小時。在此過程中不要移動板子，并用鋁箔紙包上板子以避免邊緣效應。 C. 斑點的檢測 1． 倒掉細胞，用PBS洗5次（200?l/孔）。 2． 用0.5%胎牛血清的PBS稀釋檢測抗體為1?g/ml，每孔加入100?l室溫孵育2小時。
3． 洗板5次。
4． 用0.5%胎牛血清的PBS 1:1000稀釋鏈霉親和素，每孔加入100?l室溫孵育1小時。
5． 洗板5次。
6． 通過0.45?m過濾器過濾底物（BCIP/NBT），每孔加入100?l，等待清晰的斑點形成。
7． 用自來水沖洗停止顯色，沖洗板子的后面。
8． 晾干板子。在顯微鏡下或用ELISpot計數儀對斑點計數。
9． 室溫避光儲存板子。注意：如果是未包被的板子，在使用之前需要包被抗體，包被過程為：
1． 用無菌PH7.4 PBS稀釋包被抗體濃度為15?g/ml。
2． 從密封的包裝袋中拿出ELISpot板，每孔加入50?l 70%乙醇預濕。預濕時間不要超過2分鐘。
3． 晃動板子盡快吹干，用無菌水洗5次，200?l/孔。
4． 每孔加入100?l抗體溶液，4℃過夜。
