人臍帶間質干細胞來源的exosome下調LOXL2緩解小鼠肝纖維化的作用機制研究
目的肝纖維化是肝硬化的必經中間環節,其主要病理過程是肝星狀細胞(hepatic slate cell,HSC)活化為肌成纖維細胞、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過量沉積及肝組織結構破壞。前期研究已表明人臍帶間質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)來源的exosome(huc MSC derived-exosome,huc MSC-Ex)可緩解小鼠肝纖維化,但其具體機制仍不清楚。本研究在此基礎上,進一步探討huc MSC-Ex抗纖維化的作用機制。方法分離培養huc MSC,蔗糖/重水超速離心法提取huc MSC-Ex,透射電鏡觀察huc MSC-Ex形態,Nano Sight納米顆粒跟蹤分析儀檢測huc MSC-Ex直徑分布,Western blot檢測huc MSC-Ex表面標志物CD9、CD63。體內注射四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)建立BALB/c小鼠肝纖維化模型,并應用huc MSC-Ex進行治療,分組如下:PBS組(n=10),huc MSC-Ex組(n=10);動物活體成像檢測huc MSC-Ex在小鼠體內分布,通過肝臟大體觀、H&E染色、Masson染色等技術觀察肝纖維化組織結構及膠原沉積,免疫組化和Western blot檢測賴氨酰氧化酶樣蛋白2(lysyl oxidase-like 2,LOXL2)、HSC活化指標成纖維細胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)及α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)的表達。體外誘導肝星狀細胞(LX-2)細胞活化,與huc MSC-Ex共培養,RT-PCR、Western blot和免疫熒光檢測LOXL2、一型膠原(collagenⅠ,COL1)及FAP表達。免疫組化及Western blot檢測肝組織及LX-2細胞中Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)表達;利用重組腺病毒或質粒過表達或敲除YAP,Western blot檢測LOXL2蛋白表達;熒光素酶報告基因檢測YAP對LOXL2的轉錄活性,分析YAP對LOXL2的轉錄調控作用。Western blot檢測huc MSC-Ex中14-3-3ζ表達;利用重組腺病毒轉染huc MSC過表達14-3-3ζ,收集提取并鑒定14-3-3ζ過表達exosome(Ad-14-3-3ζ-Ex);Ad-14-3-3ζ-Ex及對照組exosome(Ad-GFP-Ex)與活化的LX-2細胞共培養,Western blot、免疫熒光檢測LX-2細胞14-3-3ζ、YAP表達,分析14-3-3ζ與YAP核定位的相關性。結果Huc MSC-Ex呈球形膜性囊狀結構,直徑30~100nm左右,表達CD9、CD63等exosome表面標志物。動物活體成像顯示熒光染料標記的huc MSC-Ex主要集中于肝纖維化小鼠肝臟組織,并且在huc MSC-Ex處理的肝臟中檢測到exosome標志物CD63表達。與PBS組相比,huc MSC-Ex組小鼠肝纖維化減輕,肝組織中壞死結構減少,膠原沉積減弱,同時LOXL2表達下調、HSC活化指標FAP及α-SMA表達降低;huc MSC-Ex與誘導活化的LX-2細胞共培養后,LOXL2、COL1及FAP表達下降。在肝纖維化小鼠肝臟及活化的LX-2細胞中YAP核定位及LOXL2表達相關;在293T、LX-2、HL7702細胞中過表達YAP導致LOXL2蛋白表達增加,敲減YAP后,LOXL2蛋白表達下降;熒光素酶報告基因檢測表明YAP對LOXL2具有轉錄調控作用。在活化的LX-2細胞中,Ad-14-3-3ζ-Ex具有比Ad-GFP-Ex更強的LOXL2表達抑制及YAP核定位抑制作用。結論HucMSC-Ex通過下調LOXL2表達抑制HSC的活化,緩解肝纖維化,其機制可能通過轉運14-3-3ζ抑制YAP核定位相關。
