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磷酸化原癌基因c-kit抗體的概念:
Z初有人用電泳證明血清中抗體活性在γ球蛋白部分,故曾把抗體統稱為丙種(γ)球蛋白。后來發現,抗體并不都在γ區;并且位于γ區的球蛋白,也不一定都具有抗體活性
磷酸化原癌基因c-kit抗體(antibody,Ab)是機體免疫系統受到抗原刺激后產生的特異性球蛋白,稱免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。根據其重鏈穩定區的分子結構和抗原性的不同,可將為類Ig分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等五大類。由遺傳基因決定所產生的抗體,稱天然抗體(natural antibody),由抗原激發免疫細胞產生的抗體,稱免疫抗體(immune antibody)或稱特異地性抗體。人工制備的特異性抗體又可分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體三種類型。
磷酸化原癌基因c-kit抗體抗血清的鑒定
抗血清的效價可根據抗體的不同性質,分別采用環狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散、單向免疫擴散、溶血試驗、凝集反應、酶免疫反應及放射免疫等方法進行測定。檢查抗血清的純度可采用免疫電泳、瓊脂雙向擴散及交*反應試驗等方法檢測。
1)取適量Protein A+G Beads懸液,裝入層析柱,用10倍柱體積的PBS(或者TBS,下同)洗滌平衡層析柱。
2)含抗體的血清或其它體液高速離心后,將上清與等體積2×PBS緩沖液混合,調整pH以及離子濃度后(確認pH值為7±0.5),緩慢加入層析柱。
3)用10倍柱體積以上的PBS洗滌,至流出液無蛋白檢出。
4)加入2倍柱體積0.1 M 檸檬酸(Citrate Acid, pH 2.7)封閉流出管,靜置5分鐘后收集穿出液,重復三次。測定 OD280估算抗體濃度,如果所得抗體較多可以使用SDS-PAGE檢測純度。也可以選擇0.1 M*(Glycine, pH 3.0)洗脫。
5)洗脫后的抗體立即加入2/5體積的1 M Tris,pH 9.0中和,使用Millipore蛋白濃縮管切換到所需緩沖液,或者透析,緩沖液通常為PBS含有0.02% NaN3以及1 mM EDTA。
6)濃縮到所需體積,加入50%甘油;測定效價后,分裝并保存在-20℃,避免凍結。
磷酸化原癌基因c-kit抗體的特異性是指對相應抗原或近似抗原物質的識別能力。特異性高,抗體識別能力就強,通常以交*反應率來表示。交*反應率可用競爭抑制試驗測定。
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