脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不*的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。 elisa試劑盒
二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤
(一) 細(xì)胞融合流程
(1) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
(2) 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
(3) 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不*培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
(4) 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
(5) 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
(6) 在室溫下融合:
① 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。
③ 加預(yù)熱的不*培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7) 離心，800rpm，6分鐘。
(8) 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。
(9) 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加*培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。 elisa試劑盒
(二) HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。
一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清*培養(yǎng)液中。
因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后zui初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。 elisa試劑盒
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