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LexA酵母雙雜交系統(tǒng)
閱讀:1339 發(fā)布時(shí)間:2015-5-28
質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3,在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD(202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標(biāo)蛋白(釣餌,Bait)的融合蛋白,該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1的調(diào)控,選擇與報(bào)告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。
質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1,在其供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)(EcoR I與Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(來(lái)自于E.coli的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白)等幾種編碼序列,共同組成可以啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。
在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個(gè)報(bào)告基因Leu,它與LacZ報(bào)告基因具有相同的操縱子-LexA,但兩者啟動(dòng)子不同。
根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理,如果某一復(fù)合物同時(shí)具有DNA-BD和AD的活性,即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測(cè)蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中,然后共同轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因的酵母菌株,如果蛋白X與Y能相互作用,則啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況,就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。
如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫(kù),則可用X從該文庫(kù)中篩選出能與其相互作用的蛋白,并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。
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