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鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備
閱讀:1182 發(fā)布時間:2015-11-16人巨噬細(xì)胞可從外周血或經(jīng)斑蝥激發(fā)的皮皰液中獲取,也可從肺灌洗液或患者腹膜透析液中分離,但操作煩瑣,得量不多。許多實驗室在進(jìn)行基礎(chǔ)或配合臨床研究巨噬細(xì)胞功能及其與疾病的關(guān)系、或篩檢免疫增強(qiáng)藥物和探討其作用機(jī)制時,常選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象。
(一)鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備
1.用無菌注射器吸取3%硫代乙醇酸鈉3ml,注射于小鼠腹腔內(nèi)。
2.四日后,注射羊紅細(xì)胞(1%懸液)lml于小鼠腹腔內(nèi)。
3.注射1h后,將小鼠用頸椎脫臼法處死,解剖暴露腹腔,于腹腔靠上部位,用鑷子輕輕夾起腹膜,將腹膜剪一小口,用尖吸管注入5ml預(yù)溫的PBS,同時用手反復(fù)揉搓腹腔約1~2min,以便盡可能多地沖洗出小鼠腹腔的吞噬細(xì)胞
4.用尖吸管吸取腹腔液,置一潔凈試管內(nèi)。
5.用尖吸管將腹腔液吹打均勻(盡量避免產(chǎn)生氣泡),吸取一滴滴于載玻片上,加蓋玻片鏡檢。
(二)炭粒廓清試驗
正常小鼠肝中庫普弗細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒,脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒,據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液),間隔一定時間反復(fù)取靜脈血。測定血中炭粒的濃度,根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度,判斷巨噬細(xì)胞的功能。
(三)吞噬功能的檢測
1.雞紅細(xì)胞(CRBC)懸液的制備取雞血l~2ml,阿氏液抗凝。試驗前用無菌生理鹽水沖洗3次,然后配成5%CRBC懸液。
2.吞噬試驗取皮皰滲出液O.5ml,加上述CRBC懸液0.01 ml混勻,置37℃水浴中30min,每隔10min輕輕搖動1次。1000r/mln離心5min,棄上清液。留少許液體將細(xì)胞充分混勻.涂片,甲醇固定,吉姆薩染色,油鏡下觀察并計數(shù)100~200個巨噬細(xì)胞。
3.結(jié)果觀察
(1)吞噬細(xì)胞百分率:即100個巨噬細(xì)胞中吞噬有CRBC的細(xì)胞數(shù)。
(2)吞噬指數(shù):將100個巨噬細(xì)胞所吞噬的CRBC的總和除以100,所得每個巨噬細(xì)胞吞噬CRBC的平均數(shù),即吞噬指數(shù)。