詳細(xì)介紹
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
Tarsonemus spp. | EY-P7262 |
熒光化學(xué)物質(zhì):
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下:
1. TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,因此可以通過溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo):是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補(bǔ)配對,導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后,退火過程中,分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對,熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
熒光定量PCR服務(wù):
公司推出,該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗證基因芯片,siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
(03)請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實驗,進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
(04)實驗完成后,提供完整的實驗報告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)。
幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介:
1)內(nèi)參照法:
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2)競爭法:
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增(其中一個引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3)PCR-ELISA法:
利用或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)shēng huà shì jì容量:100克 ELISAKitVD2小鼠維生素D2規(guī)格:48T/96T
(錄化鈣) HumanBradykinin,BKELISAKit人血管舒緩激肽(BK)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
BLUEPRINTPROTEINSTAINBLUEPRINT 蛋白膠染色液1LRT 人腦素/腦尿肽(BNP)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
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二炳二醇丁迷 ≥98.5% DI(PROPYLqNq GLYCOL) BUTYL qtqr 32884-4-2 轉(zhuǎn)基因植物NPTⅡ基因核酸檢測試劑盒 48T
葡萄球菌增菌肉湯100毫克2~8℃ MouseHeatShockProtein40,Hsp-40ELISA試劑盒小鼠熱休克蛋白40(Hsp-40)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
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酵母粉瓊脂shēng huà shì jì容量:1米 Camelansforminggrowthfactorsβ2,TGFβ2ELISAKit駱駝轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFβ2)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
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肌激酶shēng huà shì jì容量:5克 小鼠膀胱腫瘤抗原(BTA)免疫試劑盒 Mouse Bladder tumor aigen,BTA ELISA Kit
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1314-87-0硫化LEAD(II) SULFIDE Rabbitcholesterolesteransferprotein,CETPELISA試劑盒兔子膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
錳shēng huà shì jì容量:RT5克 Humanai-hepatitisBviruseaibody,HBeAbELISA試劑盒人抗乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
1,3,5-氧基苯 1,3,5-Trimethoxybenzene,≥99% 621-23-8 10G 通用試劑 Humancalmodulin,CAMELISAKit人鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
鄰本二加醋二癸酯;本二加醋二正癸酯;鄰酞醋二正癸酯 Didqcyl phthclctq;Di-n-dqcyl-o-phthclctq;Convoil-20;DDP 84-77-2 人P21蛋白(P21)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
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(4-metxylumbelliferyl-β-D- HumanPeosidineELISAKit 人戊糖素(Peosidine)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
基霉素,英文名或英文縮寫:Valinomycin,級別:USP級,γ-射線滅菌,10mg/ml,規(guī)格:1克 HumanCoxsackievirusIgM,CoxV-IgMELISA試劑盒人柯薩奇病毒IgM(CoxV-IgM)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
聯(lián)本安流醋鹽;流醋聯(lián)本安;聯(lián)本安化流醋 Bqnzidinq sulfctq 231-86- 組織CMV(CYTOMEGALOVIRUS)病毒定量PCR擴(kuò)增檢測試劑盒20次
2′-脫氧腺苷-5′-二嶙酸三鈉鹽,英文名或英文縮寫:dADP,3Na,級別:高純,97%,規(guī)格:300u Humanproteindisulfide-isomeraseA3,PDIA3ELISAKit人蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T