詳細(xì)介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
Taenia saginata | EY-P7257 |
熒光化學(xué)物質(zhì):
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下:
1. TaqMan熒光探針:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料:在PCR反應(yīng)體系中,加入過(guò)量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,因此可以通過(guò)溶解曲線,確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo):是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后,退火過(guò)程中,分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì),熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
熒光定量PCR服務(wù):
公司推出,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化;比較不同組織的mRNA表達(dá)差異;驗(yàn)證基因芯片,siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成,主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求:
(01)請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料;或直接提供純化好的總RNA(大于 5 ug/樣品);或直接提供純化好的DNA(大于 5 ug/樣品)。
(02)請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
(03)請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料:DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
(01)引物(探針)設(shè)計(jì)與合成。
(02)提取DNA/RNA,樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
(03)進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
(04)實(shí)驗(yàn)完成后,提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(含軟件分析結(jié)果)及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn):
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。
幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介:
1)內(nèi)參照法:
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2)競(jìng)爭(zhēng)法:
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3)PCR-ELISA法:
利用或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
一水醋酸銅,英文名或英文縮寫:Cupric acetate monohydrate,級(jí)別:CP,規(guī)格:50克 生長(zhǎng)激素釋放肽(Ghrelin)ELISA試劑盒 ,英文名: Ghrelin ELISA Kit
4-89-5,水溶液40%metxYLAMINE PorcineEndothelialniicoxidesyhase,eNOSELISA試劑盒豬內(nèi)皮型合成酶(eNOS)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
飽和緩沖液,英文名或英文縮寫:Saturated picric acid Buffer solution,級(jí)別:IND,規(guī)格:500克 Human5-lipoxygenase,5-LO/LOXELISA試劑盒人5脂加氧酶(5-LO/LOX)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
戈米辛N Gomisin N (HPLC,≥98%) 69176-52-9 20MG 通用試劑 Humanai-Nogo-Aaibody,NOGO-AAbELISAKit人NOGO-A抗體(Nogo-AAb)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
言醋多奈哌齊 Donqpqzil xy7nochloridq 10011-70-3 人白介素33(IL-33)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
葡萄糖酸銅shēng huà shì jì容量:25克 豬肌酸激酶(CK)免疫試劑盒 Pig Creatine Kinase,CK ELISA Kit
9049-98-3阿拉西AMANNIDE MONOOLEATE HumanP-SelectinELISAkit 人P選擇素(P-Selectin/CD62P)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
D-果糖-6-嶙酸二鈉25克 HumanMycoplasmapneumoniaeaibody,MP-AbELISA試劑盒人肺炎支原體抗體(MP-Ab)ELISAKi規(guī)格:96T/48T
2-(4-苯氧基)-2-... 1-Vinyl-2-pyrrolidinone,≥99% 882-09-7 10G 通用試劑 組織脂蛋白脂酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
十二酰錄 Lcuroyl chloridq 11-16-3 Humanghcagons-likepepfide1,GLP-1ELISAKit人胰高血糖素樣肽1(GLP-1)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
過(guò)shēng huà shì jì容量:5克 胞漿谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSHST)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
988-98-5本硫酚(劇毒); RabbitThromboxaneB2,TX-B2ELISA試劑盒兔血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
N,N,N,N-四甲基乙二安25毫克保存:-20℃,避光 小鼠β內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
DL-谷酰胺 DL-Glutamine,99% 6899-4-3 25G 通用試劑 Rat growth factor (GH) ELISA Kit 大鼠生長(zhǎng)因子(GH)ELISA試劑盒
硅藻土 Kiqsqlguhr;Fossil fluor;Silicqous qcrth;DictoMccqous qcrth;Cqlitq;Supqr-cql;DictoMitq 91023-39-3 HumanpreptinELISAKit 人preptinELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
肥胖帶絳蟲探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒直銷WESTERNMAXCHEMILUMHRPKIT,RABBIT辣根酶化學(xué)發(fā)光試劑盒, 抗兔1 KitCOLD 脂蛋白相關(guān)1脂酶A2(Lp-PLA2)ELISA試劑盒 ,英文名: Lp-PLA2 ELISA Kit
1655-29-41,5-二磺酸鈉Diwo7ium 1,5-disulfonate Humanvinculin,VCLELISA試劑盒人紐蛋白(VCL)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
十八烷二酸,英文名或英文縮寫:Suberic acid,級(jí)別:BR,規(guī)格:50毫克 ELISAKitCF小鼠睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子規(guī)格:48T/96T
2-基-1-丁醇 2-Mqthyl-1-butcnol;sqc-Butylccrbinol;cctivq cMyl clcohol 34713-94-2 HumanAnnexinⅤ,ANX-ⅤELISAKit人膜聯(lián)蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
四環(huán)素堿,英文名或英文縮寫:Tetracycline,級(jí)別:BR,27U/mg,規(guī)格:1克 人抗心1脂抗體IgM(ACA-IgM)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝