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技術文章

Elisa試劑盒抽提大腸桿菌質粒

閱讀:232發布時間:2015-11-9

原理

Elisa試劑盒是將完成一個項目所需要的各種試劑、材料組合在一起,方便實驗人員使用的一種工具。由于分子生物學實驗中用到的試劑種類繁多,配置要求較高,但用量較少,因此通過試劑盒,可以減輕實驗人員的工作量,而且保證實驗結果的穩定。

目前用于質粒抽提的Elisa試劑盒很多,絕大部分Elisa試劑盒均在堿裂解法的基礎上,利用硅膠柱吸附質粒DNA,去除雜質,之后用洗脫緩沖液將吸附的質粒DNA洗脫下來。此法所得的質粒DNA絕大部分為超螺旋DNA,純度較高;同時,此法不需要使用酚、等有機溶劑,操作更為簡便。

實驗試劑

1、LB液體培養基:10g細菌培養用胰蛋白胨(tryptone),5g細菌培養用酵母抽提物(yeast extract),10gNaCl,溶于800ml水中,加熱溶解后,用10mol/L NaOH調節pH值至7.0,121℃高壓滅菌20min,備用。

2、50mg/ml氨芐*溶液:1g氨芐*溶于200ml水中,用0.22μm濾膜過濾除菌,分裝至小管中,-20℃貯存。

3、質粒小量抽提Elisa試劑盒

4、無水乙醇

5、瓊脂糖凝膠電泳相關試劑

Elisa試劑盒實驗步驟

1、將RNase A溶液全部加入溶液I中,均勻混合后4℃保存。

2、在Wash Solution中加入4倍體積的無水乙醇。

3、從平板培養基上挑選單菌落接種至5ml含有50μg/ml氨芐*的液體LB培養基中,37℃過夜培養,取1.5ml的過夜培養菌液,12000r/min離心2min,棄上清液。

4、用250μL Solution I(含RNase A),充分懸浮細菌沉淀,靜置2min。

5、加入250μL Solution II,輕輕地上下翻轉五六次,至溶液呈澄清透明狀。

6、加入350μL Solution III,溫和混勻,靜置5min后,12000r/min離心10min。

7、將Elisa試劑盒中的EZ-10 Column置于Colleetion Tube上,將6的上清液轉移至EZ-10 Column中,8000r/min離心2min,棄去濾液。

8、在EZ-10 Column中加入500μL Wash Solution,10000r/min離心1min。

9、重復步驟8.

10、棄去濾液,10000r/min再離心2min,以充分去除Wash Solution。

11、將EZ-10 Column轉移到1個新的1.5mL離心管中,在EZ-10 Column中加入50μL Elution Buffer,靜置5min,10000r/min離心2min,離心管中所得即為質粒DNA。

12、取5μL樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

Elisa試劑盒注意事項

1、嚴格按照Elisa試劑盒說明書上的操作步驟進行,不可隨意更改相關溶液體積及或離心時間、速度等。

2、在將溶液加入EZ-10 Column中時,槍頭不要觸碰硅膠膜。


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