β-抑制蛋白調(diào)控的磷酸化
通過(guò)利用兔子的骨骼肌，發(fā)現(xiàn) β-抑制蛋白可以調(diào)控由血管緊張肽Ⅱ型1a 受體（AT1aR）刺激的肌球蛋白 MLC 的磷酸化。β-抑制蛋白屬于抑制蛋白家族， 包括 β-抑 制蛋白-1 和 β-抑制蛋白-2, 它可以在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)[5]. β-抑制蛋白介導(dǎo) G 蛋白耦聯(lián)受體和其他一些受體的信號(hào)通路的調(diào)控， 在細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及免疫功能中都發(fā)揮了重要作用，并且與一些疾病的發(fā)病密切相關(guān)。 一些研究表明，β-抑制蛋白-1 對(duì)于激活 RhoA/ROCK 以及迫使形成肌纖 維 是 不 可 缺 失 的 . 一 些 G 蛋 白 偶 聯(lián) 受 體（ GPCRs），如血管緊張肽Ⅱ型 1a 受體（ AT1aR），參與調(diào)控細(xì)胞收縮[12].而 AT1aR 的拮抗劑Ⅱ（ AngⅡ）能夠很好地防治血管收縮類的疾病[22]. 另外，ElieSimard 等利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，由于β-抑制蛋白-1 的 163-253 位氨基酸包含 MYPT-1的結(jié)合區(qū)域，所以 β-抑制蛋白-1 1-418 位氨基酸和 1-253 位氨基酸會(huì)與 MYPT-1 的 643-943 位氨基酸相互作用。 當(dāng)受到 AT1aR 的刺激時(shí)，β-抑制蛋白-2 也會(huì)與 MYPT-1（ 肌球蛋白調(diào)控區(qū)域）相結(jié)合。 通過(guò) β-抑制蛋白誘導(dǎo)會(huì)激活 AT1aR 的信號(hào)通路，促進(jìn) MLC 的磷酸化，而 β-抑制蛋白-2/MYPT-1 復(fù) 合體會(huì)阻斷到 MLCP 亞 基的入口 ,親和性降低，所以 β-抑制蛋白-2 會(huì)使 MLC 去磷酸化。 周期性的 MLC 磷酸化會(huì)加速細(xì)胞收縮
此研究表明，β-抑制蛋白對(duì)于 MLC 的磷酸化與去磷酸化是不可缺失的，當(dāng)肌肉細(xì)胞中缺失 β-抑制蛋白-1,在應(yīng)對(duì) AT1aR 的刺激下，MLC 的磷酸化水平會(huì)下降。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這可能是基于兩方面的原因： 其一是 MYPT-1 遠(yuǎn)離了 MLCP 的復(fù)合體；其二是依賴 β-抑制蛋白-1 的 RhoA 因子水平下降[24],隨后 ROCK 活性損失 ,MLCP 活性增強(qiáng) ; 但當(dāng)肌肉細(xì)胞中缺失 β-抑制蛋白-2, 在 AT1aR 的拮抗劑 Agonist 的刺激下， 會(huì)使 MLC 磷酸化水平升高。 有趣的是，兩種 β-抑制蛋白會(huì)相互調(diào)控 MLC的磷酸化，缺失 β-抑制蛋白-1 或者 β-抑制蛋白-2 對(duì) 細(xì)胞收縮和運(yùn)動(dòng)都會(huì)有相似的效果 . 因此 ,MLC 的 磷酸化對(duì)細(xì)胞收縮和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)起著關(guān)鍵性作用
ELC 與 RLC 相互作用對(duì)磷酸化的影響
上文提到，肌球蛋白由重鏈與輕鏈組成，而輕鏈又是由必須輕鏈（ ELC）與調(diào)節(jié)輕鏈（ RLC）構(gòu)成。對(duì)于所有的肌肉組織， 收縮與釋放都是由細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+含量變化調(diào)控的。 在橫紋肌中，Ca2+結(jié)合到細(xì)肌絲的肌鈣蛋白的復(fù)合體上激活肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白（ actin-myosin）ATP 酶，因而發(fā)生肌肉收縮。elisa試劑盒
相比較而言， 在軟體動(dòng)物與脊椎動(dòng)物的平滑肌和非肌肉細(xì)胞中， 收縮的方式有兩種： 其一直接由Ca2+結(jié)合到肌球蛋白ⅡELC2上；其二是由 RLC 的N-端區(qū)域磷酸化，這種磷酸化由 Ca2+依賴的 ML-CK 調(diào)控的。肌球蛋白調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制以原子級(jí)的分辨力揭示，扇貝肌球蛋白Ⅱ的 RD 構(gòu)造包含著 ELC和 RLC,以及可以結(jié)合一部分輕鏈的 HC[25, 26]. 在扇貝肌球蛋白中，Ca2+會(huì)結(jié)合到 ELC-N 端結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的 EF 臂的上。 2012 年 Shaowei Ni 等通過(guò)用雞的平滑肌 HMM 在 Sf9 細(xì)胞中表達(dá)后得到 HC、RLC 與 ELC 的全長(zhǎng)。 研究發(fā)現(xiàn)，必須輕鏈（ ELC）與調(diào)節(jié)輕鏈（ RLC）交界處的修飾會(huì)阻斷激活平滑肌肌球蛋白依賴的磷酸化。他們表達(dá)了 16 個(gè)平滑肌水解重酶解肌球蛋白（ SmHMM），兩條 MLC 與周圍的 HC 的銜接處發(fā)生突變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）RLC被 MLCK 磷酸化；2） 亞基組成是正常的，突變并不會(huì)降低 ELC 或者 RLC 結(jié)合到 HC 的能力；3）依賴肌動(dòng)蛋白激活的 ATPase 的動(dòng)力學(xué)以及在體外運(yùn)動(dòng)的 機(jī) 械 性 能 在 去 磷 酸 化 的 狀 態(tài) 下 與 WTHMM 相一致；4） 對(duì)于磷酸化的水解重酶解肌球蛋白（ HMM），缺失肌動(dòng)蛋白（ actin）狀態(tài)下其 ATPase活性會(huì)被抑制。 另外，當(dāng)阻斷 RLC 與 ELC 的相互作用時(shí)， 磷酸化不再有激活 HMM 捕捉肌動(dòng)蛋白的能力。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象與 RLC 的 M129Q與 G130C 的突變有關(guān)。 M129Q 和 G130C 對(duì)于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，激活捕捉 actin 的能力起著關(guān)鍵作用。 同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)， 與 Asp-131 相互作用的 HC 突變體Q826A,也 可以起穩(wěn)定 RLC/ELC 的 相互作用（ 圖3） . 通過(guò)突變 HC、RLC 以及 ELC 去破壞三者之間的相互作用，若不發(fā)生磷酸化，所有的突變體都與野生型（ wt）的現(xiàn)象相似，相反，肌球蛋白會(huì)運(yùn)動(dòng)緩慢，ATPase 活性下降。 分子動(dòng)力學(xué)研究表明，阻斷RLC/ELC 的相互作用會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白彈性增加，很可能會(huì)阻礙磷酸化的激活。 因此作者猜想，RLC磷酸化重要的功能就是去維持 RLC 與 ELC 相互作用的完整性。 一旦 RLC/ELC 相互作用阻斷，結(jié)構(gòu)破壞，就不會(huì)再受到磷酸化的調(diào)控的影響[27].elisa試劑盒
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