一、試驗原理
在動脈粥樣硬化和血管重建術(shù)后再梗死的主要病理基礎(chǔ)上，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的移行和過度增殖起著極其重要的作用。當血管內(nèi)皮細胞受損時，單核細胞和血小板可黏附并分泌細胞生氏因子，可刺激VSMC移行與增殖。抑制VSMC移行和增殖的物質(zhì)可抑制動脈粥樣硬化病變形成和血管成形術(shù)后再梗死。取動物或人血管的中膜進行分離，在合適的環(huán)境下能使VSMC生長和進行傳代，常用家兔、大鼠、牛、豬、羊及流產(chǎn)胎兒的主動脈、肺動脈及腦動脈。培養(yǎng)方法根據(jù)實驗要求選取，在相同條件下觀察細胞生長密度、DNA合成，可觀察藥物對VSMC生長的影響。
二、材料
1．待檢藥物。
2．動物：兔或大鼠等。
3．試劑：O．25％*、O．02%EDTA、10％CS、Hanks液、培養(yǎng)液、結(jié)晶紫、3 H—TdR藥盒。
4．器材：凈化工作臺、CO2孵箱、倒置顯微鏡、液閃儀、分光光度計、多孔掃描分光光度計。
三、實驗方法
(一)血管平滑肌組織塊培養(yǎng)
1．將實驗動物在無菌條件下取出所需血管，以Hanks液洗去血污，在盛有：Hanks液的培養(yǎng)皿中剝離外膜，縱行剪開血管，剝?nèi)?nèi)膜，剪去兩端鉗夾過的組織，以鋒利的*剪成約1mm3小塊，放試管中用Hanks液沖洗，自然沉降，去上清液。
2．用彎頭種植針輕刺小塊組織，以O(shè)．5 mm間距排列在培養(yǎng)瓶底上，輕輕翻轉(zhuǎn)瓶底向上在37℃的C02孵箱中靜置2～4h(為使組織塊微干涸，以利于貼附)。
3．打開瓶蓋，斜持瓶向其底角部加少量培養(yǎng)液(仍底向上)，再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中，放回培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
4．每3d換液1次，一般4～7d后細胞從組織塊周圍長出，2～3周后出現(xiàn)致密的細胞層，此時取出組織塊，使細胞生長至融合。
(二)傳代細胞培養(yǎng)
1．當原代細胞生長融合成單層細胞時，傾去培養(yǎng)液．以Hanks液洗滌培養(yǎng)瓶2次，然后以O(shè)．25％*O．02％EDTA混合液覆蓋細胞表面，室溫下作用約2 min。elisa試劑盒
2．在倒置顯微鏡下見到大部分細胞收縮、邊緣清楚時，即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化。傾去消化液，加入含l0%CS的培養(yǎng)液，用吸管輕輕反復吹打瓶壁，把細胞吹打成懸浮狀并進行細胞計數(shù)。
3．以5×104～5×105個／ml濃度接種在新培養(yǎng)瓶中，在37℃的CO2孵箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，至細胞生長至致密單層時進行第二次傳代。
(三)待檢藥物處理
一般傳至5～6代，得到數(shù)量較大而又均一的細胞時進行實驗。給藥組加入不同濃度藥物，預孵一定時間，與對照組比較，觀察藥物對生長因子的作用。實驗常在96孔或24孔培養(yǎng)板上進行。
四、結(jié)果分析與鑒定
(一)細胞觀察
1．在倒置相差顯微鏡下，當細胞長滿瓶底時，典型的平滑肌細胞為梭形，平行呈束狀排列，密集與稀疏交叉呈“峰”與“谷”狀，峰處細胞密集、多層；谷處細胞稀疏甚至沒有細胞。
2．電鏡下觀察，可把平滑肌細胞分為“合成型”與“收縮型”兩型。前者胞質(zhì)充滿楹面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但粗肌絲或細肌絲很少，肌動蛋白的抗體熒光染色為陰性，細胞無收縮功能。“收縮型”細胞是平滑肌細胞的典型表現(xiàn)，主要特征為胞質(zhì)內(nèi)有束狀肌絲，細胞有收縮功能。
3．原代培養(yǎng)的zui初1周內(nèi)細胞以“收縮型”為主，以后逐漸向“合成型”轉(zhuǎn)化且大量繁殖。傳代培養(yǎng)zui初從“收縮型”向“合成型”轉(zhuǎn)化很快，6～10d后又復原，但已無收譬功能。
(二)MTT比色法
1．MTT能進入活的線粒體內(nèi)，與各種脫氫酶反應(yīng)，可用于測定細胞的成活及增殖。elisa試劑盒
2．以PBS溶解MTT制成5mg／ml溶液，抽濾滅菌。按每孔100μl培養(yǎng)液加入10μl的量把MTT加入細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。
3．取出培養(yǎng)板，吸出孔中培養(yǎng)液，每孔加入100μl酸性異丙醇(含0．04 ml／L HCl)，使深藍色結(jié)晶*溶解。
4．在室溫下放置數(shù)分鐘，確認結(jié)晶*溶解后即把培養(yǎng)板在570 nm、630 nm處．控l設(shè)在1．99(如樣品著色過強，則設(shè)在1．00)的多7L掃描分光光度計下讀數(shù)。在加入異丙后l h內(nèi)測定完畢。
5．也可以使用DMSO每孔320μl代替異丙醇溶解細胞內(nèi)MTT，在酶聯(lián)免疫測定儀上司570nm或570 nm、630 nm雙波長處測定吸光值并分析。
(三)3 H-TdR放射免疫測定
1．將待測細胞吸去培養(yǎng)液，每孔加入含3 H—TdR的培養(yǎng)液200μl(含放射量3．7×10 4Bq)，37℃孵育24 h后終止培養(yǎng)。
2．以冷PBS200μl清洗3次，加入4℃的10％TCA 200 μl，放于4℃冰箱內(nèi)30 min。
3．吸去TCA，加入一乙醇(1：2)混合液200μl漂洗，吸去液體，晾干。
4．加入O．4 mol／L NaOH溶液每孔200μl溶解細胞，在56℃恒溫箱中放置2h。
5．吸出全部液體，注入含有5ml閃爍液的閃爍瓶中，加蓋搖勻，放置2h后進行液閃測定。
五、注意事項
1.平滑肌細胞取材廣泛，但以年幼動物血管的平滑肌細胞較易培養(yǎng)成活。
2．CS的質(zhì)量與實驗關(guān)系密切。有條件時可加入PDGF等細胞生長因子。
3．在加入藥物前，先以含O．4％CS的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞48～72h，然后改換含10％CS的培養(yǎng)液，可提高細胞對藥物的敏感性。
