1. 試劑配制
（1）重鉻酸鉀液 重鉻酸鉀2.5g，醋酸5ml，蒸餾水95ml
（2）苯胺藍桔黃G液 苯胺藍0.5g，桔黃G2g，磷鎢酸1g，蒸餾水100ml
（3）酸性復紅液 酸性復紅0.5g，蒸餾水100ml
2.染色步驟
（1）中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規脫蠟至水。
（2）重鉻酸鉀液10min。
（3）蒸餾水沖洗2min，蒸餾水2次。
（4）酸性復紅液2min，蒸餾稍洗。
（5）苯胺藍液20min，95%乙醇快速分化。
（6）直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
3.結果
膠原和網狀纖維呈藍色，軟骨、粘液、淀粉樣變物質呈淡藍色，神經膠質纖維、肌纖維和酸性顆粒呈紅色，髓鞘和紅色呈桔紅色。
4.注意事項
（1）酸性復紅液易溶解于水，肉眼觀察切片上保留一定的紅色。
（2）苯胺藍液染色后，用95%乙醇分化時，須用顯微鏡觀察掌握。
（3）對陳舊的固定標本，其染色效果較差，可增加染色時間。
（4）另張切片，可同時作膠原纖維對照染色而進行鑒別組織成分。
二、Masson三色染色法
1.試劑配制
（1）Masson復合染色液 酸性復紅1g，麗春紅2g，桔黃G2g，0.25%醋酸300ml。
（2）亮綠染色液 高綠SF0.1g，0.2%醋酸100ml。
2.染色步驟
中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規脫蠟至水。
（1）Masson復合染色液5min。
（2）0.2%醋酸水溶液稍洗。
（3）5%磷鎢酸5-10min。
（4）0.2%醋酸水溶液浸洗2次。
（5）亮綠染色液5min，0.2%醋酸水洗2次。
（6）無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
3.結果
膠原纖維呈綠色，肌纖維呈紅色，紅細胞呈桔紅色。
4.注意事項
（1）Masson復合染色液，經磷鎢酸分化時須用顯微鏡控制肌纖維清晰為止。
（2）亮綠染料可用苯胺藍替換，可用來作為對比觀察染色的效果。
三、顯示膠原纖維、網狀纖維和彈力纖維的三聯染色法（1993年）
1.試劑配制
（1）*硫酸液 0.5%*水溶液中加入5ml的硫酸。
（2）維多利亞藍染色液 維多利亞藍2g，糊精0.5g，*4g，蒸餾水200ml。將上述物質混合后加熱煮沸，邊煮邊攪拌，約5min。然后用另一容器取30%三氯化鐵水溶液25ml，另行加熱煮沸后慢慢倒入上述混合液中繼續煮沸3min，不斷攪拌溶液呈膠體狀。去火冷卻過濾，將濾紙上的殘渣連同濾紙放在60℃恒溫箱中烤干。殘渣呈深藍色細顆粒狀粉末，再溶于400ml的70%乙醇液中。然后加濃鹽酸4ml和*5g放置至成熟后使用。
（3）麗春紅染色S染色液 0.5%麗春紅S水溶液15ml，苦味酸飽和水溶液85ml。
（4）Gomori氨性銀改良液 取5%*水溶液5ml，滴加濃氨水由棕黑色變清為止，再加入3%氫氧化鈉水溶液5ml，此時該液突變紫黑色，這時再加入氨水使之變清晰為止。zui后用蒸餾水補足至50ml，盛棕色試劑瓶中，置于冰箱中備用較長時間。
2.染色步驟
（1）中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規脫蠟至水。
（2）*硫酸液氧化3min后，自來水浸洗后，用2%草酸漂白2min。
（3）5%硫酸鐵銨1min。
（4）Gomori氨性銀改良液染1min。
（5）蒸餾水洗2次，用15%甲醛液還原1min。
（6）蒸餾水洗2次，0.2%氯化金30s，蒸餾水洗1次。
（7）70%乙醇浸一次，再浸入維多利亞藍液中染30min-1h。
（8）95%乙醇分化1min左右。
（9）浸入蒸餾水中1min后，用麗春紅S染色液染色2min。
（10）直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
3.結果
膠原纖維呈紅色，網狀纖維呈黑色，彈力纖維呈綠色，肌肉和紅細胞呈淡黃色。
4.注意事項
氨性銀液滴染時，要用干凈吸管，防止銀液污染而發生沉淀。氨性銀液作用后的切片不能傾倒，應將蒸餾水沖洗切片上的銀液，這樣就不會使銀液表面揮發的銀顆粒而沉積在組織上。
第二節 膠 原 纖 維
一、膠原纖維的分布和組成成分
膠原纖維是結締組織中的三種纖維之一，分布，含量zui多。主要分布于、鍵、韌帶、骨、透明軟骨、動脈、腸壁、子宮和基底膜等，膠麻纖維具有韌性大，抗拉力強的特點。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成膠水，稱白明膠。膠原纖維和網狀纖維的基本構造相似，都以膠原單位(蛋白質為主的大分子)為基本單位。膠原單位接連和融合形成網狀纖維;它是粗約1μm左右的分支狀纖維，形成全身組織的支架，在HE染色中看不清楚。但其外面裹著的一層類蛋白，憑借鍍銀法可以清楚地顯示出來，故又稱為嗜銀纖維。
膠原纖維單位主要由纖維母細胞合成。其他如平滑肌細胞等也能產生。膠原單位的形成開始于細胞的粗面內質網，合成比構成膠原單位的α肽鏈更長的前α肽鏈，經高爾基體分泌出細胞，在細胞外液的內切肽酶作用下，切去前α肽鏈的附加肽段而形成膠原單位；再經細胞外液的賴氨酰氧化酶作用使兩條肽鏈通過醛醇或醛胺縮合構成共價交聯。這樣膠原單位分子之間就形成了穩定的，形成膠原微纖維，然后再聚合而成膠原纖維。
二、膠原纖維染色的應用
膠原纖維染色在病理診斷上主要用于鑒定梭形、纖維形細胞腫瘤的組織來源：常常要在纖維、平滑肌和神經三者之中作出選擇。還能使用于其他的情況下，如觀察動脈硬化的心臟，在HE切片中，心肌內散在的小疤痕灶和心肌均被染作紅色，而作膠原纖維染色可將膠原組織和心肌組織明顯地區分開來。早期肝硬化用膠原纖維染色，也可使小葉之間少量增生的膠原纖維突出地顯示出來。由干膠原纖維是由成纖維細胞產生的一種纖維蛋白成分，常常被酸性染料染色。
l. Van Gieson苦味酸酸性復紅法(1889年)
[試劑配制]
(l) Van Gieson液 l%酸性品紅水溶液10ml，苦味酸飽和水溶液(約l.22%)90ml。
(2)Weigert鐵蘇木素溶液 甲液：蘇木素lg,95%或無水乙醇100ml；乙液：29%三氯化鐵水溶液4ml，蒸餾水95ml，鹽酸l ml。
臨用時取甲液和乙液等量混合即可。鐵蘇木素不能像明礬蘇木素一樣配制后放置，因鐵與染色劑的色素可引起化合而形成不溶性沉淀。所以，以鐵作為媒染液時，必須與染液分別配制、分別應用或臨時混合應用。
[染色方法]
(1)組織固定于10%甲醛液，常規脫水包埋。
(2)組織切片脫蠟至水。
(3)用Weigert蘇木素液染5~l0min。
(4)自來水沖洗數分鐘。
(5)根據染色的深淺可用0.5%鹽酸乙醇分化。
(6)自來水洗至變藍；用蒸餾水洗。
(7)用Van Gieson液染1~5min。
(8)傾去染液，直接用95%乙醇分化和脫水。
(9)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 膠原纖維呈紅色，肌纖維、胞質及紅細胞黃色，胞核呈黑色。
[注意事項]
(1)目前以苦味酸、復紅的Van Gieson染液直接染此一種溶液即可。
(2)Weigert鐵蘇木素分甲、乙兩液，應于臨用前將兩液等量混合使用，而不宜預先混合，否則易氧化沉淀而逐漸失其染色能力。
(3) Van Gieson染色液分別在臨用時混合，防止放置時間長，則酸性品紅不易著色。
2. Siriured染色法
這種方法可使膠原纖維長期保存，是不易褪色的一種好方法。
[試劑配制]
(l)Siriusred 飽和苦味酸液 0.5%Siriured l0ml，苦味酸飽和液90ml。
(2)天青石藍液 天青石藍B1•25g，鐵明礬1.25g，蒸餾水250m1。
溶解煮沸，待冷過濾后，加入甘油30m1，然后再加入濃鹽酸5ml。
[染色方法]
(1)組織固定于10%甲醛液，常規脫水包埋。
(2)切片脫蠟至水。
(3)入天青石藍液染5~10min，
(4)蒸餾水洗多次。
(5)Siriured飽和苦味酸液染15~30min。
(6)無水乙醇直接分化與脫水。
(7)二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 膠原纖維呈鮮紅色，細胞核綠色，其他為黃色。
3. Lillie改良Van Gieson法(1965年)
[試劑配制]
A. 用1%醋酸配成0.1%快綠FCF 液，或為得到較藍的綠色用3%毛綠S(Wool greenS )。
B. 且0.2%酸性復紅，0.2%紫胺(Violamine)或用0.1%~0.5%麗春紅S(ponceau S) 溶于飽和的苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)按常規將切片脫蠟至水。
(2)用Harris明礬蘇木素液染3min。
(3)自來水洗，鹽酸乙醇分化數秒鐘。
(4)自來水洗至顯藍，蒸餾水洗。
(5)在A溶液中染4min。
(6)在1%醋酸中洗2次。
(7)在B溶液中染l0~l5min。
(8)在1%醋酸中洗2min。
(9)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 結締組織紅色，肌肉、胞質灰綠色，紅細胞綠色，核藍黑色。
4. Clark改良Van Gieson臺盼藍法(1971年)
用于膠原纖維、包括非常細的纖維，以及肌肉角化上皮的染色。
[固定] 甲醛固定液。
[試劑配制]
(l)A液 0.3g萘酚黃S（naphthol yellow S）溶竄犯100mI蒸餾水。
(2)B液 0.2g酸性復紅溶于100ml蒸餾水中。
(3)C液 0.2g臺盼藍溶于100ml 蒸餾水中。
染色液由40份A溶液，2.5份B溶液和2份C溶液組成。每40分A溶液加入，0.4ml濃鹽酸。
[染色方法]
(1)石蠟切片，脫蠟至水
(2)在Weigert鐵蘇木素中5ml。
(3)自來水洗。
(4)在染色液中染l0min。
(5)在水中迅速洗一下即經過50%、70%與95%乙醇，無水乙醇兩次。
(6)二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 核-藍黑色；胞質-黃色，膠原纖維-粗纖維紅色，細纖維藍色。
[說明] 本法中的Weigert鐵蘇素液染色，可改用棓花青-鉻礬溶液中染16 h。
5 . Biebric猩紅染色法 Lillie，1965年
[顯示目的] 膠原纖維、網狀纖維、肌肉、胞質。
[固定] 甲醛液，Orth液。
[試劑配制]
(l)A液 Weigert鐵蘇木精，見苦味酸酸性復紅法。
(2)B液 0.2gBiebrich猩紅溶于100ml1%醋酸。
(3)C液 0.1g苯胺藍溶示100ml飽和苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)常規脫蠟至水。
(2)在A溶液中染5min。
(3)自來水沖洗。
(4)在B染液中染4min。
(5)自來水洗。ELISA試劑
(6)在C染液中染5min。
(7)直接移入1%醋酸中3min。
(8)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 結締組織藍色，腎小球基質藍色，網狀纖維藍色，紅細胞橙紅至猩紅色，肌肉粉紅色，胞質粉紅色至灰色，核黑藍色，粘液淺藍色。
6. 苦味酸氨基黑染色法 L i1lie，1965年
[顯示目的] 膠原纖維、網狀纖維、基膜、腎小球基質。ELISA試劑
[固定] 任何固定劑均可。
[試劑配制]
(l)A液 煌紫素R(Brilliant purpurin R)0.6g；偶氮復紅G(azo-fuchsin G)0.4g；冰醋酸1ml，蒸餾水加至100m1，上述兩種染料先各自用1%醋酸配成1%溶液，以6﹕4比例混合后再用。
(2)B液 氨基黑10B，5~100mg；苦味酸飽和水溶液100m1。同樣濃度的苯胺藍或甲基藍均可用來代替氨基黑(又稱蔡酚藍黑)，粘液可得到較好的顯示。
[染色方法]
(1)切片常規脫蠟至水。
(2)在Weigert鐵蘇素中染6min。
(3)自來水洗。
(4)在A染液中染5min。
(5)流水中洗。
(6)在B染液中染1~5min。ELISA試劑
(7)在1%醋酸中分色2min。
(8)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 膠原纖維、網狀纖維和基膜深綠色；粘液深綠色，上皮細胞胞質棕色，肌肉淺綠色，紅細胞紅色。
7. Petersen 酸性茜藍改良法
[顯示目的] 膠原與網狀組織、骨鉻肌、心肌橫紋、心肌間板。
[固定] Zenker液，Helly液、Bouin液或甲醛液。
[試劑配制]
(1)A液 即緩沖的酸性茜藍溶液。酸性茜藍2B，0.25g；硫酸鋁5g；蒸餾水50m1。煮沸5min。冷卻，過濾，再補足到原來的體積。然后加20ml的Sorensen檸檬酸鹽溶液(檸檬酸晶體21g，lN NaOH，200m1。加蒸餾水至1000ml)和30ml 0.lN鹽酸緩沖到pH為2.25。
(2)B液 即苯胺藍橘黃G溶液。苯胺藍0.5g; 橘黃G，2g；蒸餾水100ml，冰醋酸8ml，煮沸，冷卻，過濾。
[染色方法]
(1)常規石蠟切片，脫蠟至水。
(2)在A液中染3min。
(3)在蒸餾水中快速洗2次。
(4)在5%磷鎢酸液中分色并媒染2~3min。
(5)蒸餾水洗。
(6)在未經稀釋的B液中染2~3min。如染色結果太深，可用1、2或3倍體積的蒸餾水稀釋。
(7)蒸餾水中略洗。
(8)先用95%乙醇后用無水乙醇脫水。
(9)二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果] 膠原與網狀結締組織藍色，染色質磚紅色，肌組織根據所用不同品種的固定劑染色從深品紅色至亮橙色，紅細胞橙紅色，粘液淡藍色，神經節細胞淡品紅色，腺細飽根據其組成從淺藍色至品紅色。
8. 顯示膠原纖維、細胞和肌肉的新染法
[固定]中性甲醛液，石蠟切片。
[試劑配制]
(1)Ponceau's染色液 0.5%Pohceau's(麗春紅S，上海試劑三廠)水溶液l0~15ml，苦味酸飽和水溶液85~90ml。
(2)Victoria blue'B 染色液 Victoria blue'B(維多利亞藍，B，上海試劑三廠) 0.5 g， 70%乙醇100m1。
[染色方法]
(1)組織切片脫蠟至水。
(2)70%乙醇稍洗后，入Victoria blue'B染色液中l5min。
(3)95%乙醇中分化數秒鐘。
(4)用蒸餾水洗2次。
(5)用Ponceau's染色液滴染2min。
(6)直接用無水乙醇分化與脫水。
(7)二甲苯透明，中性樹膠封固。
[結果]膠原纖維呈鮮紅色，細胞核和血細胞呈綠色，肌肉呈黃色。
