染色質免疫共沉淀技術（ChIP）] 實驗原理 基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的 蛋白結合的 DN段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。elisa試劑盒CHIP 不僅可以檢測體內反式因子與 DNA 的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP 與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CH [ChIP 染色質 免疫共沉淀 細胞蛋白質 抗體] 實驗原理 基 本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋 白結合的 DN段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。CHIP 不僅可以檢測體內反式因子與 DNA 的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP 與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP 與基因芯片相結合建立的CHIP-on- chip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表達調控中的作用。由此可見，隨著 CHIP 的進一步完善，它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。 實驗試劑 1. 37% 甲醛 2. * 3. PBS 4. 蛋白酶抑制劑 （protease inhibitor） 5. RnaseA 6. 0.5MEDTA 7. 1MTris.HCl（PH6.5） 8. 10 mg/ml 蛋白酶 K 等。 實驗設備 1. 10 cm 平皿 2. 水浴鍋 3. 細胞 4. 超聲破碎儀 5. 15 ml 離心管 6. 高速離心機 7. 交聯儀等。 實驗材料 培養好的細胞 實驗步驟 1. 細胞的甲醛交聯與超聲破碎 （天） 1） 取出 1 平皿細胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37% 甲醛，使得甲醛的終濃度為 1%（培養基共有 9 ml）。 2） 37 攝氏度孵育 10 min. 3） 終止交聯：加*至終濃度為 0.125M.450 ul 2.5M *于平皿中。混勻后，在室溫下放置 5 min 即可。 4） 吸盡培養基，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 次。 5） 細胞收集細胞于 15 ml 離心管中（PBS 依次為 5 ml,3 ml 和 3 ml）。預冷后 2000rpm 5 min 收集細胞。 6） 倒去上清。按照細胞量，加入 SDS Lysis Buffer.使得細胞終濃度為每 200ul 含 2×106 個細胞。這樣每 100ul溶液含 1×106 個細胞。再加入蛋白酶抑制劑 （protease inhibitor） 復合物。假設 MCF7 長滿板為 5×106個細胞。本次細胞長得約為 80%.即為 4×106 個細胞。因此每管加入 400ul Lysis Buffer.將 2 管混在一起，共 800ul. 7） 超聲破碎：VCX750,25% 功率，4.5S 沖擊，9S 間隙。共 14 次。 2. 除雜及抗體哺育 （天） 1） 超聲破碎結束后，10,000 g 4 度離心 10 min.去除不溶物質。留取 300ul 做實驗，其余保存于-80 度。300ul中，100ul 加抗體做為實驗組；100ul 不加抗體做為對照組；100ul 加入 4ul5MNaCl（NaCl 終濃度為 0.2M），65度處理 3 h 解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。 2） 在 100ul 的超聲破碎產物中，加入 900ulChIPDilutionBuffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度顛轉混勻 1 h. 3） 1 h 后，在 4 攝氏度靜置 10 min 沉淀，700rpm 離心 1 min. 4） 取上清。各留取 20ul 做為 input.一管中加入 1ul 抗體，另一管中則不加抗體。4 度顛轉過夜。 3. 檢驗超聲破碎的效果 （天） 取 100ul 超聲破碎后產物，加入 4ul5MNaCl,65 度處理 2 h 解交聯。分出一半用酚/抽提。電泳檢測超聲效果。 4. 免疫復合物的沉淀及清洗 （第二天） 1） 孵育過夜后，每管中加入 60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4 度顛轉 2 h. 2） 4 度靜置 10 min 后，700rpm 離心 1 min.除去上清。 3） 依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟：加入溶液，在 4 度顛轉 10 min,4 度靜置 10 min 沉淀，700rpm 離心 1 min,除去上清。 洗滌溶液： a. 低鹽溶液一次 b. 高鹽溶液一次 c. LiCl 溶液一次 d. TE buffer 兩次 4） 清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：elisa試劑盒100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共 1 ml。每管加入250ul 洗脫 buffer,室溫下顛轉 15 min,靜置離心后，收集上清。重復洗滌一次。zui終的洗脫液為每管 500ul. 5） 解交聯：每管中加入 20ul 5M NaCl（NaCl 終濃度為 0.2M）。混勻，65 度解交聯過夜。 5. DNA 樣品的回收 （第三天） 1） 解交聯結束后，每管加入 1ulRNaseA（MBI），37 度孵育 1 h. 2） 每管加入 10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10 mg/ml 蛋白酶 K。45 度處理 2 h. 3） DNA 片段的回收-omega 膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于 100ulddH2O. 6. PCR 分析 （第三天） ChIP- chip 技術對于大規模挖掘順式調控信息成績，同時它可以用于胚胎干細胞和一些疾病如癌癥（cancer）、心血管疾病和*神經紊亂的發生的機制。 研究人員還可以利用這項技術開發一些治療方法。目前 ChIP-chip技術研究主要集中于兩個領域：及轉錄因子的結合和條件特異性；組蛋白的修飾，組蛋白 修飾蛋白和染色體重建。 ChIP-chip 在描述轉錄結合因子動力學中的研究、染色體結構組分的分布、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應用也十分廣泛。ChIP-chip 技術的優點是，可以在體內進行反應；在給定的檢驗細胞環境的模式下得到 DNA相互關系的簡單影像；使用特異性修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉錄修正的蛋白質的相關位點；直接或者間接（通過蛋白質與蛋白質的相互作用）的鑒別基因組與蛋白質的相關位點。缺點是：需要一個特異性蛋白質抗體，有時難于獲得；為 了獲得高豐度的結合片段，必須實驗演示胞內條件下靶標蛋白質的表達情況；調控蛋白質的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。 總之，ChIP-chip 技術的發展為析活細胞或組織中 DNA 與蛋白質的相互關系提供了一個極為有力的工具。elisa試劑盒在未來的研究中，將對芯片的構建進行改進，提高其實用性。使用易于獲得抗體，增加這種方法的可用性。
