結蛋白（desmin）基因位于人類染色體2q35[1],編碼的結蛋白分子量為52 000. 結蛋白作為一種細胞骨架蛋白，是Ⅲ型中間纖維的重要成員之一[2-3],主要存在于肌細胞中,如平滑肌、骨骼肌、心肌[4-6]以及神經肌肉接頭處，如突觸后膜、肌腱接點和肌纖維膜附著點[7-8].
結蛋白除在細胞內起到機械性的支撐作用外,還與信號轉導、心肌細胞收縮、再生、線粒體功能調節等功能有關[9-10].結蛋白參與多種心臟相關疾病,例如結蛋白基因突變可以導致擴張型心肌病、結蛋白相關心肌病等[11-13];過表達突變型的結蛋白可造成肌漿膜內異常結蛋白積聚、排列紊亂，使心肌肥厚、功能受損，導致充血性心力衰竭;結蛋白表達異常出現于不同原因導致的心力衰竭過程中[14-15].
在利用基因敲除小鼠進行的研究中發現，結蛋白基因敲除小鼠在胚胎發育期沒有明顯異常表型,但是小鼠出生后發生骨骼肌、心肌和平滑肌功能障礙[10],組織學分析顯示肌結構嚴重破壞和退化,平滑肌發育不全和退化,心肌細胞進行性退化和壞死[16].其他研究也證實,結蛋白是骨骼肌和心肌發育過程中重要的標志和功能蛋白[11,17].
但是,結蛋白是否僅在出生后影響肌肉組織的發育,在胚胎早期發育中是否也發揮作用，目前尚未闡明。本文利用非洲爪蛙作為模式動物,研究結蛋白對早期胚胎發育中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑人 絨 毛 膜 促 性 腺 激 素（human chorionic go-nadotropin,hCG,Sigma 公司 ,美國 ），DNaseⅠ、 限制性核酸內切酶、T7聚合酶、T4連接酶和RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit （Thermo Fermentas 公司,美國），RNA純化試劑盒RNeasy Mini Kit（QIA-GEN 公司， 德國），Dig-UTP、anti-Dig-AP、BM Purple（Roche公司,瑞士），RNA合成試劑SP6 mMessageTMKit（Ambion 公司，美國），Taq DNA 聚合酶、PrimeS-TAR@HS DNA 聚合酶 、SYBR@Premix Ex TaqTM定量PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。
1.1.2 引物和反義嗎啉代寡核苷酸結 蛋 白 克 隆 引 物 序 列 為: 上 游 引 物 :5′ -CCGGGAATTCCAACCATGAGCCAGTCCTAC -3′ ;下游引物：5′-AATTGGTCCGCTTCCTGTGTAG-3′，定量PCR 引物為：上游引物：5′-GGCACGTGTGGAGGTA-GAAA-3′， 下游引物：5′-GCGTCTCTCCAGGTCTAT-GC-3′，其他定量 PCR 引物參見文獻[18].
根據結蛋白基因5′端序列 設計特異性封閉結蛋白的反義嗎啉代寡核苷酸（morpholino oligonu-cleotide,MO）， 命 名 為 desmin MO, 序 列 為 :5′ -GGTTGCTTGAATAGGATGGCTCAT-3′，由美國 GeneTools 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 質粒構建根據結蛋白基因序列 （GenBank Accession No:BC077922.1）設計克 隆 PCR 引物 ,通過 RT-PCR 對結蛋白的編碼區進行擴增,雙酶切PCR 產物并將其連接至pCS2+質粒上，命名為 pCS2+-desmin.
1.2.2 胚胎操作及顯微注射試驗前12 h 左右注射 300~600 U hCG 誘導雌性爪蛙排卵。體外受精 30 min 后，去除受精卵外的膠質膜,在0.1×MBSH[1×MBSH:88 mmol / L NaCl、2.4 mmol / L Na2CO3、1 mmol / L KCl、0.82 mmol / LMgSO4、0.41 mmol / L CaCl2、0.33 mmol / L Ca （NO3）2,10 mmol / L HEPES,pH7.4]中培養至相應發育階段。 胚胎發育階段的劃分依照Nieuwkoop 和 Faber 分期[19].將50 ng desmin MO 在胚胎 4 細胞期時注射入 4個細胞中,以實現對結蛋白的敲降,將胚胎置于恒溫培養箱中進行培養,用于表型觀察及基因表達分析.
1.2.3 逆轉錄和實時定量 PCR收集胚胎并提取RNA, 以 DNaseⅠ消化并 用RNeasy Mini kit 純化 . 取 1 μg 各胚胎總 RNA 用RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit 逆轉錄為cDNA. 以逆轉錄的 cDNA 為模板，采用 TaKaRa 的SYBR Green 試劑盒進行實時定量 PCR.
1.2.4 整胚原位雜交將pCS2 +-desmin 用 EcoR Ⅰ，pCS2 +-xbra 用 SalⅠ，pCS2+-Sox17α 用 Cla Ⅰ，pCS2+-Sox2 用 EcoR Ⅰ單酶切,隨后使用T7 RNA 聚合酶制備反義探針，反應體系中加入Dig-UTP 作為探針標記。
收集并固定爪蛙胚胎,用梯度濃度乙醇進行再水化,用蛋白酶K 處理后進行預雜交和雜交，加入anti-DIG-AP 抗體后，與底物液 BM purple 進行顯色反應.
1.2.5 Western blot收集目標胚胎，利用全蛋白試劑盒（南京凱基）提取蛋白, 經 10%SDS-PAGE 電泳分離后， 轉移至PVDF 膜上，依次孵育一抗和二抗，zui后利用發光液顯色. β-actin（鼠源）抗體由美國 Santa Cruz 公司,結 蛋白 （兔源 ）抗體購自美國 abcam 公司 ,抗體稀釋比例均為1∶1 000.
1.3 統計學方法
定量RT-PCR 所得數據采用平均值 ± 標準誤（x ± sx）表示， 利用 SPSS 軟件進行重復測量設計的方差分析，P ≤ 0.05 為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 結蛋白在不同物種間的序列比對
針對人、小鼠、大鼠、雞以及熱帶爪蛙結蛋白的蛋白序列，采用 clustal×2 進行氨基酸序列對比。 結果顯示， 結蛋白在 6 個不同物種間存在高度同源性，非洲爪蛙結蛋白氨基酸序列與人類以及小鼠的相似性為79%,與雞和大鼠的相似性為 80%,與熱帶爪蛙的相似性為97%. 在結蛋白 3 個主要功能區域中[3],rod區與C 末端 tail 區在 6 個物種間具有高度的相似性,只是head 區物種之間的差異較大，但各物種結蛋白在此區域都有1 個保守區段，由 7 個芳 香 族 氨 基 酸 殘 基 和 氨 基 末 端 保 守 的 九 肽（‘SSYRRTFGG’）組成（圖1）。
2.2 結蛋白在非洲爪蛙胚胎發育不同時期的表達elisa試劑盒
為研究結蛋白在非洲爪蛙胚胎發育過程中不同時期的表達,收取受精卵期（st.1）、卵裂期（st.4）、囊胚期（st.7）、原腸胚期（st.11）、神經胚期（st.13、st.18）、尾芽期（st.28、st.32）、蝌蚪期（st.42）的胚胎，提取了不同時期胚胎的總RNA 進行實時定量 RT-PCR檢測，結果顯示，結蛋白的微弱表達起始于囊胚期，在神經胚早期（st.13）出現明顯表達,隨后在神經胚期、尾芽期以及蝌蚪期持續高表達（圖2A）。
隨后利用原位雜交技術對結蛋白在胚胎發育過程中的表達部位進行檢測,結果顯示,在st.11 時結蛋白表達于外胚層以及中胚層區域，內胚層未檢測到其表達;st.18時表達于主干區域、肌、軸旁中胚層以及肌節;st.32主要表達于肌節和心臟等肌肉組織,在神經脊、后腦等神經組織中也有表達（圖2B）。
2.3 敲降結蛋白影響胚胎早期發育
elisa試劑盒通過敲降實驗來研究結蛋白在早期發育中的作用時， 首先利用 Western blot 驗證 desmin MO 的敲降效率。結果顯示，與對照胚胎相比，注射 desminMO 的胚胎中結蛋白的表達量顯著減少（圖 3A）。
胚胎發育過程中,在st.12 時對照胚胎形成胚孔,而注射desmin MO 的胚胎發育遲緩，其胚孔尚未形成.
當發育至st.32,與正常胚胎相比，敲降胚胎前后體軸明顯縮短,頭部以及眼也明顯變?。▓D3B、C）。
2.4 敲降結蛋白影響胚層分化
為研究結蛋白敲降后對胚層分化的影響,利用原位雜交技術檢測內、中、外胚層標志基因的表達.結果顯示,注射desmin MO 的胚胎，其 內胚層標志基因Sox17α， 外胚層標志基因 Sox2 的表達量都明顯下降,然而泛中胚層基因Xbra 的表達量無明顯變化（圖4A）。 利用實時定量 RT-PCR 檢測其他標志性基因的表達,發現中胚層基因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b、Chordin、DKK1、Wnt8,內胚層標志基因Mixer、Sox17α、GATA4、GATA6,以及外胚層標志基因Sox2、Sox3、Geminin 均受到不同程度的抑制（圖4B）。
3 討 論
細胞骨架包括微絲、微管和中等纖維，在細胞中具有多種重要的生物學功能.
結蛋白是肌細胞中主要的中等纖維,在維持細胞內結構和胞外基質聯結中起重要的作用.文獻報道,結蛋白基因敲除小鼠在胚胎發育期沒有明顯異常表型，僅在生后發生肌肉功能障礙。 但是，出生后小鼠肌結構嚴重破壞和退化，平滑肌發育不全和退化，心肌細胞進行性退化和壞死[16],結合其他文獻報道表明結蛋白在肌肉發育中發揮重要作用[10,20].但是結蛋白是否在胚胎發育早期發揮作用尚未闡明. 本文利用非洲爪蛙作為模式動物，研究了結蛋白在胚胎發育中的表達模式及其對早期胚層分化的影響。
首先，通過多重序列比對發現在不同物種間結蛋白的氨基酸序列是高度保守的,提示結蛋白功能的保守性. 進而對結蛋白的表達模式進行進一步的鑒定。 因為以往實驗條件的限制，已有的關于結蛋白在細胞分化過程中表達的報道，無論是在體內還是在體外培養條件下的觀察, 都是從較晚的時期開始，如7 d 以上的雞胚，8.25 d 以上的鼠胚，或是十幾天以上的雞、鼠胚胎的肌肉所做的原代培養細胞[21-24],非洲爪蛙結蛋白的表達開始于st.14,高表達于 st.28[25].
elisa試劑盒本研究利用原位雜交技術檢測其表達模式，發現原腸胚期之前的結果與以往報道類似，幾乎觀察不到陽性染色,但是從 st.18 期已觀察到明顯表達。 進而利用較為靈敏的實時定量PCR 檢測出結蛋白在 st.7 已有微弱的表達,在神經胚早期即開始有明顯表達.
這提示結蛋白可能在胚胎發育早期階段發揮作用.
在獲得了結蛋白表達于胚胎發育早期的結果后,利用敲降方法進一步研究其功能,發現結蛋白敲降導致胚胎發育遲緩,同時各胚層標志基因均受到不同程度的抑制,胚層分化受到影響.
研究報道,結蛋白缺陷引起心肌相關疾病[12],而心肌細胞起源于中胚層,同時也受到內胚層信號的影響[26].進一步檢測中胚層、內胚層中心臟發育相關標志基因的表達發現,中 胚 層 基 因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b,內胚層基因 GATA4、GATA6 也隨著結蛋白的敲降而受到了抑制,而這些基因在早期參與或影響了心臟的發育.
以上心臟發育相關基因表達受抑的結果提示,雖然結蛋白缺失小鼠在胚胎期沒有明顯表型,僅在出生后出現心肌的發育異常,但結蛋白可能在胚胎發育早期階段即開始發揮作用,zui終導致了出生后的發育缺陷,但是對于這一結論還需要進一步的實驗來驗證.
綜上所述,在非洲爪蛙胚胎發育過程中,結蛋白的低水平表達起始于囊胚期,敲降結蛋白阻礙了胚層分化,抑制心臟發育相關標志基因的表達.
