基礎知識背景 — 什么是小G蛋白？
小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同時具有GTP酶活性，小G蛋白家族成員在細胞信號通路中發揮分子開關的功能，參與調控很多生物學過程。小G蛋白的共同特點是，當結合了GTP時即成為活化形式，這時可作用于下游分子使之活化，而當GTP水解成為GDP時（自身為GTP酶）則恢復到非活化狀態。這一點與G蛋白里的Gα類似，但是小G蛋白的分子量明顯低于Gα。
在細胞中存在著一些專門控制小G蛋白活性的小G蛋白調節因子，有的可以增強小G蛋白的活性，如鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鳥苷酸解離抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。
個被發現的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的產物。小G蛋白的Ras超家族由超過150個成員組成，基于它們的序列同源性，被分成若干亞家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。
小G蛋白超家族成員及其相關功能：
Ras | 細胞增殖 | DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRAS; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2 |
Rho | 細胞骨架的動力與形態 | RHOA; RHOB; RHOBTB1; RHOBTB2; RHOBTB3; RHOC; RHOD; RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1; RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42 |
Rab | 膜轉運 | RAB1A; RAB1B; RAB2; RAB3A; RAB3B; RAB3C; RAB3D; RAB4A; RAB4B; RAB; RAB5B; RAB5C; RAB6A; RAB6B; RAB6C; RAB7A; RAB7B; RAB7L1; RAB8A; RAB8B; RAB9; RAB9B; RABL2A; RABL2B; RABL4; RAB10; RAB11A; RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14; RAB15;RAB17; RAB18; RAB19; RAB20; RAB21; RAB22A; RAB23; RAB24; RAB25; RAB26; RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; RAB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38; RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL;RAB40B; RAB40C; RAB41;RAB42; RAB43 |
Rap | 細胞粘附 | RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C |
Arf | 囊泡轉運 | ARF1; ARF3; ARF4; ARF5; ARF6; ARL1; ARL2; ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C; ARL6; ARL7; ARL8; ARL9; ARL10A; ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13B |
Ran | 核運輸 | RAN |
Rheb | mTOR途徑 | RHEB; RHEBL1 |
RGK | | RRAD; GEM; REM; REM2 |
Rit | | RIT1; RIT2 |
Miro | 線粒體轉運 | RHOT1; RHOT2 |
Ras蛋白主要參與細胞增殖和信號轉導；Rho蛋白對細胞骨架網絡的構成發揮調節作用；Rab蛋白則參與調控細胞內膜交通（membrane traffic），其他家族成員也在細胞信號通路中發揮著非常重要的作用。
因此，研究GTP酶（GTPase）的活化調控機制具有廣泛而深遠的生物學意義。
傳統檢測Rho 蛋白活化水平的方法主要為pull-down檢測。pull-down法往往存在耗時長、需要樣本量大、不太適合高通量檢測等缺點。為克服傳統方法這些方面的缺點，Cytoskeleton公司開發了新一代的G-LISA™檢測方法，用于快速簡便地檢測GTP酶活化水平。
G-LISA實驗原理及操作步驟
1.首先將效應蛋白的受體結合域（RBD）包被96孔板；
2.樣本中GTP(活化狀態)結合形式的蛋白分子則可結合到板上，而GDP(無活性狀態)結合形式蛋白則不結合；
3.洗去未結合的蛋白；
4.然后依次加入特異性的一抗和HRP-二抗進行孵育結合；
5.后利用合適的酶底物OPD或化學發光試劑顯色。
Swiss 3T3 細胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）
傳統Pull down法和G-LISA法的比較
原理 | 用包被效應蛋白的親和磁珠選擇性的結合有活性的GTPase，用western blot檢測信號 | 用包被效應蛋白的96孔板選擇性的結合有活性的GTPase 用ELISA檢測信號 |
實驗設備 | SDS-PAGE、Western blot相關儀器 | ELISA相關儀器 |
上樣量 | 300 - 2000 µg per assay | 5 - 50 µg per assay |
樣品數量 | Up to 10 samples | Up to 96 samples (or more) |
結果定量 | WB具有很窄的線性范圍。此外，樣品的多次操作也會導致某種程度上的變異分析。 | 提供定量的數字讀數 |
反應時間 | 10-12h | ＜3h |
G-LISA法對比傳統的pull down，主要有操作簡便、上樣量少、可同時檢測多個樣本、反應時間短、定量結果準確、與小鼠、大鼠和人的組織和細胞兼容等優勢。
小G蛋白活化檢測試劑盒Pull-down實驗結果展示：
Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2min
Lanes 2 & 3: Persistent serum starvation
Lanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard
小G蛋白活化檢測試劑盒G-LISA實驗結果展示：
分別用CN01（藍色Activators）和LPA（紅色）處理后RhoA的活化進程
