高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態熔解曲線的基因分析新技術，具有*的敏感性，可以檢測出單個堿基的差異。
作為一種穩健的"post－PCR"技術，它不受突變堿基位置與類型的限制，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解即可完成對樣品的分析。HRM技術因操作簡便快捷、成本低廉、結果準確，并且實現了真正的閉管操作而受到普遍關注。
HRM原理：
在PCR反應前將新型DNA飽和熒光染料加入反應體系，然后將PCR產物直接導入高分辨熔解分析儀中，在一定的溫度范圍內將PCR擴增產物進行加熱變性，儀器的光學檢測系統采集、分析熒光信號并繪制溫度熔解曲線，根據不同熔解曲線形狀來區分（單個）堿基差異。
廣泛的 HRM 分析應用領域是基因篩查。基因篩查是搜索 PCR 擴增片段中是否存在未知變異，它可在測序步驟之前進行或者作為替代測序方法。由于 PCR 產物突變可導致 DNA 熔解曲線的形狀改變，因此它可以利用 HRM分析檢測。雜交雙鏈 DNA 樣本擴增并熔解時，其熔解曲線不同于純合野生型或突變樣本。如果操作得當，可以減少至少95%的測序工作量。隨著DNA染料和分析儀器的發展，HRM技術還將繼續完善和改進，在遺傳病分子診斷領域發揮更多的作用。
HRM應用：
• 基因篩查 (突變研究) | • 雜合性研究 |
• 突變分析 | • 物種鑒定 |
• 單核苷酸多態性 (SNP) 檢測 | • 甲基化分析 |
作為專注于PCR領域超過24年的高品質試劑供應商，Solis BioDyne為您推薦，5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預混Mix（PCR）：
名稱 | 貨號 | 兼容的PCR儀器 |
5x HOT FIREPol EvaGreen HRM Mix (NO ROX) | 08-31-00001 | Bio-Rad: CFX96™ & CFX384™
Qiagen: Rotor-Gene® 6000
Eppendorf: Mastercycler®: ep realplex2 & ep realplex4
Illumina: The Eco™
Roche: LightCycler® 480 |
* 不含參比染料ROX，如需要含ROX，請選擇：08-33-00001
5X熱啟動EvaGreen高分辨率熔解曲線分析-預混Mix（PCR）提供如下組分：
*的性價比（進口品質，國產價格）：
Solis BioDyne | 08-31-00001 | 1ml（250次） | 386 | 1.54 |
Thermo | 4415452 | 5*5ml（2500次） | 18856 | 7.54 |
Qiagen | 206546 | 25ml（2000次） | 21810 | 10.9 |
DBI | DBI-2232 | 1000次 | 11000 | 11 |
天根（Tiangen） | FP210-02 | 500次 | 2480 | 4.96 |
宇恒生物（UE） | S2013 | 500次 | 2300 | 4.6 |
推薦的qPCR反應體系配置：
5x HOT FIREPol® EvaGreen® HRM Mix | 4 µl | 1x |
正向引物 (10 pmol/µl) | 0.16-0.5 µl | 80-250 nM |
反向引物 (10 pmol/µl) | 0.16-0.5 µl | 80-250 nM |
DNA模板 | 可變 | 可變 |
H2O（PCR級） | up to 20 µl | |
Total | 20 µl | |
* DNA模板濃度：cDNA 0.1 pg/μl -10 ng/μl ; gDNA 10 pg/μl – 4 ng/μl
推薦的qPCR反應程序：
起始激活（熱啟動） | 95ºC | 12 min | 1 |
變性 | 95ºC | 15 s | 40 |
退火 | 60º-65ºC | 20 s |
延伸 | 72ºC | 20 s |
發表文章實驗結果展示：
【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?” European Journal of Human Genetics 26 (2018): 1708-1712.
使用Solis試劑盒，分析PAX2基因4號外顯子的錯義突變
【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.” Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.
使用Solis試劑盒，分析CDKAL1基因SNP
HRM分析成功的關鍵：
1.保持較短的擴增片段，實現gao的靈敏度。與較大的擴增片段相比，100 bp 左右的擴增片段可簡化單核苷酸熔解曲線的檢測。
2.確保 PCR 擴增片段的特異性。錯配產物和引物二聚體可使數據解釋復雜化。引物濃度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范圍及使用熱啟動DNA 聚合酶將有助于獲得高特異性。
3.確保反應使用足夠的模板。一般而言，Ct 應低于30，以生成足夠的材料，實現準確的熔解分析。
除了上述的穩健的HRM分析預混Mix產品，Solis BioDyne為客戶提供終點PCR（end-point PCR），qPCR（real-time PCR），反轉錄PCR（Reverse transcription），以及其它PCR所需的配套試劑。產品線縱覽圖如下：
Solis BioDyne來源于歐盟-愛沙尼亞共和國，專注PCR領域超過24年，Solis BioDyne一直致力于開發和生產高品質的生命科學試劑，現已成為當今歐洲的試劑供應商之一。高標準的生產標準和服務使Solis BioDyne成為值得信賴的首xuanPCR供應商。我們的DNA聚合酶，PCR Master Mixes，qPCR Mixes和其它試劑被110多個國家的研究者所使用，包括頂ji研究機構和生物技術公司。
Solis BioDyne擁有獨jia的蛋白質穩定技術專li，確保其PCR酶與PCR Mixes產品具有*的穩定性，研究者可以常溫運輸以及常溫下配置PCR反應體系（無需冰盒）。即使是室溫放置30天，其酶活性也沒有損耗。
作為Solis BioDyne在中國的區域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的Solis BioDyne產品以及訂制服務。
