小鼠絲裂原激活蛋白激酶13elisa
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小鼠絲裂原激活蛋白激酶13elisa
注意事項：1. ELISA用的所有液體系統，記得一定要預先調PH值到7.2-7.4之間，按照說明書都無菌過濾過。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加鹽酸調酸一點。Trizma base配出來，PH在9.98,必須調PH!否則ELISA中抗原抗體根本不能正常結合。蛋白對于PH值極度敏感。2. 無菌要求多高，現在不知道。建議無菌配好的液體放在4度冰箱保存。每次用之前，放在室溫下至少15分鐘。ELISA用的液體，室溫的溫度，效果比較好。洗包被液的時候，直接把板子翻過來，棄掉液體。在厚厚的吸水紙上，用力拍打板子，力求把孔中的液體*棄干凈。用WASH BUFFER洗滌三次。因為孔的容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆蓋滿。所以，建議洗板子的時候，每孔加350ul左右。注意事項：1.每次洗滌的時候，盡量拍干孔中液體。這樣洗滌得比較干凈。2. 孔中沒有液體時候，動作一定要快！！！ELISA包被后的孔，不能干掉！否則非常影響結果。3.封閉。用是1%BSA in 1XPBS. 無菌過濾，4度保存，用之前放在室溫復溫。封閉液可以封閉全孔，所以每孔加300UL封閉液，室溫1小時。4. 棄掉封閉液，拍干。洗滌三遍。步驟如前。5. 加標準品和樣品。標準品儲存濃度很高，而且蛋白很忌反復凍融。建議次使用時，分裝。可以48孔一只，-80度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且濃度會衰減。取16孔標準品的量。舉例，我的標準品儲存濃度是270ng/ml, 標準品分7個點，濃度是1000pg/ml，每孔100ul, 2倍遞減，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7個孔我需要0.2ng標準品。做ELISA必須有復孔。所以，兩排14個孔我需要0.4ng標準品, 1.5ul。標準品稀釋步驟：取7個EP管，第1管放400ul緩沖液，第2到7管放200ul緩沖液。將1.5ul標準品加入到管中，200ul槍輕輕吹打混勻。從第1管中取200ul加入第2管中，吹打均勻。依次稀釋。第7管有400ul液體，zui后只用200ul。標準品加樣步驟：從第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2復孔中。第2到7孔，參考上述步驟。第8孔，H1和H2加沒有標準品的緩沖液，作為陰性對照。樣本加樣：血清或者細胞上清，解凍之后混勻，建議3000RPM離心10分鐘，沉淀液體中的固體雜質。按照順序，每孔加100ul樣本，記得做復孔。加樣體積一定要一樣，但是動作要快。樣本還是一定要保證加到管底，不要粘附到管壁上。標準品和樣品，每孔100ul，室溫孵育2小時。6. 棄掉液體，拍干。洗滌3遍。7. 加檢測抗體（detection antibody,尾端有*biotin），每孔100ul（儲存液也是放-80度，用之前解凍后加緩沖液混勻，稀釋到工作濃度，緩沖液的PH值都已經調到7.2-7.4之間）。室溫孵育2小時。備注：以上這些步驟沒有要求避光。所以，每次加樣之后，只要保證把貼膜都貼牢，防止液體蒸發和孔間干擾即可。板子可以放在操作臺上。不過因為操作習慣，即使不避光的步驟，也可以把板子放在室溫的抽屜里。8.棄掉檢測抗體液，拍干。洗滌三遍。9. 加Streptavidin-HRP(親和素-辣根過氧化物酶)，這個一直4度保存，使用的時候200倍稀釋（96孔，9.6ML液體，加48ul的Streptavidin-HRP，9552ul的緩沖液）。100ul每孔，室溫，避光（這步開始要避光），孵育20分鐘。10. 棄掉液體，拍干。洗滌三遍。11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前臨時混起來。儲存的時候A，B兩液分別儲存在4度冰箱。每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室溫，避光，20分鐘。
*半*連接酶催化亞基elisa
Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1Aelisa
組蛋白脫乙酰基酶1elisa
*1βelisa
Bcl2關聯X蛋白elisa
血管生成素樣蛋白2elisa
抗肌蛋白elisa
鈉/鉀離子轉運ATP酶β4肽elisa
UDP葡萄糖神經酰胺葡萄糖基轉移酶elisa
半*豐富血管生成誘導因子61elisa
