一、技術(shù)簡介
外泌體是這幾年開始興起的一個朝陽領(lǐng)域，它是細(xì)胞分泌的一種直徑在30-100nm（另一種說法是 30-150nm）的膜泡結(jié)構(gòu)，可以介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)的交換和信息通訊。有研究分為9個類別依次為：單囊泡、雙囊泡、多膜泡、小雙層膜泡、橢圓膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不規(guī)則膜泡，其中在不同類別的囊泡中可以發(fā)現(xiàn)三個附加特征：表面具涂層的膜泡、內(nèi)含纖維的膜泡、電子致密囊泡。
相信大家對這些早已耳熟能詳，在此不多做贅述。外泌體的分離是困擾剛剛進(jìn)入該領(lǐng)域研究者的主要問題，從分離角度講目前大家分離外泌體主要通過一下集中手段：差速超速離心法、梯度密度離心法、沉淀試劑盒、凝膠排阻分離法、膜親和試劑盒等手段，后兩者主要用于同時分離所有的胞外囊泡組分。以上諸多分離方法中，梯度密度離心的分離方法是*可以得到較高純度的分離方法，但是操作相對復(fù)雜，目前使用并不廣泛。以目前的手段來說，我們很難拿到純的外泌體組分，而多是以外泌體為主要組分的胞外微囊泡，在這里對兩者不做過多區(qū)分。關(guān)于分離的一些經(jīng)驗技巧，朋友們可以參考 “外泌體之家” 分離鑒定板塊的相關(guān)貼子，適時在以后的文章中會詳細(xì)展開。
外泌體的鑒定是既分離后又一個困擾研究者的問題，一般研究者需要通過透射電鏡觀測樣本中是否存在外泌體樣結(jié)構(gòu)（通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形），通過粒子直徑分析系統(tǒng)測算和統(tǒng)計樣品中粒子的直徑分布，通過western blot檢測樣品中是否有外泌體相關(guān)marker蛋白的富集。另外，當(dāng)電鏡圖觀測到的樣品結(jié)構(gòu)不是典型外泌體樣結(jié)構(gòu)時，還需要增加免疫膠體金電鏡進(jìn)行驗證。本文將通過納米顆粒與外泌體電鏡圖像的對比來總結(jié)外泌體電鏡圖的鑒別方法，爭取讓大家明白為什么外泌體電鏡需要看到具有膜結(jié)構(gòu)的茶托樣納米粒子才能算是看到了外泌體。本司采取通過透射電鏡確定外泌體大小。
二、實驗流程
1. 外泌體戊二醛固定。
2. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15min。
3. e酸固定：加入0.5 mL 2%e酸溶液 4度固定2h。
4. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。
5. 脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1mL梯度脫水分別靜置15min，再用1mL 100%乙醇脫水2次，每次20min。
6. 置換：用1mL丙酮置換2次，每次靜置15min。
7. 浸漬。
8. 包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。
9. 聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48h。
10. 染色：醋酸雙氧鈾染色 10min后清洗；醋酸鉛染色 10min后清洗。
11. 上機(jī)檢測。
12. 提供實驗報告。
三、服務(wù)說明及結(jié)果
1. 客戶提供：外泌體（30 μl）或由我司分離得到外泌體。
2. 公司提供：基本實驗步驟、圖片、數(shù)據(jù)分析結(jié)果。
3. 實驗周期：10個工作日。
