一、儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性等份，并在制備后在-20°C下儲存。避免反復凍融循環。

1.蛋白質原液（溶液A）

將100?L反應緩沖液（例如，1 M碳酸鈉溶液或pH~9.0的1 M磷酸鹽緩沖液）與900?L目標蛋白質溶液（例如，抗體，蛋白質濃度>2 mg/mL，如果可能）混合，得到1 mL蛋白質標記儲備溶液。

注：

1）蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH值低于8.0，則使用1 M碳酸氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調節至8.0-9.0。

2）蛋白質應溶解在1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，pH值為7.2-7.4。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須針對1X PBS（pH 7.2-7.4）進行透析，以去除廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和醋酸銨）。

3）不純抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩定的抗體將不能很好地標記。疊丨氮丨化丨鈉或硫柳汞的存在也可能干擾共軛反應。疊丨氮丨化丨鈉或硫柳汞可通過透析或旋轉柱去除，以獲得zui佳的標記結果。

4）如果蛋白質濃度小于2 mg/mL，則接合效率會顯著降低。為獲得zui佳標記效率，建議zui終蛋白質濃度范圍為2-10 mg/mL。

2.熒光燈™ 488硒儲備液（溶液B）

將無水二甲基亞砜加入iFluor瓶中™ 350 SE制成10 mM儲備溶液。用移液管或旋渦攪拌均勻。

注：開始接合前，制備染料儲備溶液（溶液B）。及時使用。染料原液的長期儲存可能會降低染料的活性。溶液B在避光防潮的情況下，可在冰箱中保存兩周。避免凍融循環。

二、樣本實驗方案

該標記方案是針對山羊抗鼠IgG與iFluor的結合物而建立的™ 350東南。你可能需要進一步優化你的特定蛋白質。

注：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比率，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記會有害地影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質結合物會降低靈敏度。

運行共軛反應

1.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10:1為起點：將5?L染料儲備液（溶液B，假設染料儲備液為10 mM）加入蛋白溶液（95?L溶液A）小瓶中，有效搖勻。假設蛋白質濃度為10mg/mL且蛋白質的分子量為200KD，則蛋白質的濃度約為0.05mm。

注：我們建議使用10:1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）。如果太少或太高，確定zui佳染料/蛋白質比分別為5:1、15:1和20:1。

2.在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化結合物

1.以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料-蛋白質結合物的實例。

2.按照生產說明書制備葡聚糖凝膠G-25柱。

3.將反應混合物（從“運行共軛反應”）裝入Sephadex G-25柱頂部。

4.一旦樣品剛好在樹脂頂面以下，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需樣品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質結合物的部分。

注：

1）為了立即使用，染色蛋白結合物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

2）為了長期儲存，染料-蛋白質結合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

三、示例數據分析和圖表

表征所需的染料-蛋白質結合物

取代度（DOS）是表征染料標記蛋白質的zui重要因素。DOS較低的蛋白質通常具有較弱的熒光強度，但DOS較高的蛋白質（如DOS>6）也傾向于降低熒光強度。大多數抗體的zui佳DOS推薦在2到10之間，這取決于染料和蛋白質的性質。為了有效的標記，取代度應控制在6-8摩爾iFluor™ 350硒相當于一摩爾抗體。以下步驟用于確定iFluor的DOS™ 350硒標記蛋白。

測量吸收率

為了測量染料-蛋白質結合物的吸收光譜，建議根據染料的消光系數將樣品濃度保持在1-10?M的范圍內。

讀取280 nm處的OD（吸光度）和染料zui大吸收（對于iFluor，?max=450 nm）™ 350種染料）

對于大多數分光光度計，樣品（來自色譜柱部分）需要用去離子水稀釋，以便OD值在0.1到0.9的范圍內。280nm處的吸光度是蛋白質的zui大吸收，450nm是熒光的zui大吸收™ 350東南。為了獲得準確的DOS，確保共軛物中沒有非共軛染料。

計算DOS

Figure 1.HeLa細胞與（微管蛋白+）或不與（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后用iFluor™ 488山羊抗鼠IgG結合物（綠色，左側）或Alexa Fluor?488山羊抗鼠IgG結合物（綠色，右側）。細胞核用hoechst33342（藍色）染色。

美國AAT Bioquest Inc。（前身是ABD Bioquest，Inc。）是一家為從事生命科學研究、診斷研發及藥物開發的科學家研發、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括顯色、熒光和生物發光技術。AAT Bioquest的產品幫助科學家和生物醫藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。作為AAT Bioquest Inc。的中國區域代理，艾美捷科技為中國客戶提供光譜學檢測技術并應用于生化、生理代謝和細胞分析領域的產品，包括顯色，熒光和發光技術等全系列解決方案。