艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒背景：

半胱天冬酶不能切割FLICA抑制劑探針；相反它與靶上的FMK形成不可逆的共價鍵

并被抑制進一步的酶活性。信息和通信技術聚半胱天冬酶FLICA探針FAM-VAD-FMK可作為一種通用的檢測細胞凋亡的試劑，因為它被許多類型的激活的胱天蛋白酶。更具體地靶向特定的胱天蛋白酶酶，使用ICT的專用FLICA試劑之一。ICT有套件用于檢測：caspase-1（YVAD或WEHD）（也可識別Caspases 4和5）、-2（VDVAD）、-3/7（DEVD）、-6（VEID）、-8（LETD）、-9（LEHD）和-10（AEVD）。FLICA套件也有紅色或遠紅色熒光標記。Caspases，像大多數其他關鍵細胞一樣存活酶在目標氨基酸中有一定的容許性它們將識別并切割的序列。盡管FLICA試劑含有各自優選的不同氨基酸靶序列caspase，它們也可以識別其他活性caspase

存在。

FLICA可用于標記懸浮或粘附細胞組織切片。用FAM-FLICA標記后，細胞可以固定或

凍結的對于標記后將被石蠟包埋的組織，使用ICT紅色硫羅丹明SR-FLICA探針；不要使用綠色FAM-FLICA探針作為FAM染料將在石蠟包埋過程中淬滅。用FAM-FLICA標記的細胞可以用試劑進行反染色例如紅色活/死染色物碘化丙啶（包括在FAMFLICA試劑盒中）和7-AAD（目錄#6163）壞死。核形態可以同時使用Hoechst 33342，一種藍色DNA結合染料（包括在FLICA試劑盒中）。細胞可以通過熒光顯微鏡直接觀察，或者熒光強度可以被量化使用流式細胞儀或熒光平板讀取器（圖8）。FAM-FLICA最佳激發波長為488-492nm峰值發射在515-535nm。  

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒組分：

試驗尺寸套件包含：

•1瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制劑試劑

•1瓶10X凋亡洗滌緩沖液（15 mL），#635

•1瓶固定劑（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639

標準尺寸套件包含：

•4瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制劑試劑

•1瓶10X凋亡洗滌緩沖液（60 mL），#634

•1瓶固定劑（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639。

將未開封的套件和每個未開封的組件儲存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的溫度下儲存6個月，避光，解凍時間不超過在這段時間內兩次。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒實驗準備:

用FLICA染色細胞可以在幾個小時內完成。然而FLICA用于活細胞，需要定期維護和提前幾天栽培。此外，一旦正確的數字已經培養了個細胞，必須為實驗分配時間治療或半胱天冬酶激活過程。創建細胞群，例如：

a、 暴露于實驗處理的細胞

b、 接受安慰劑的陰性對照細胞群治療

當FLICA檢測到催化活性形式的胱天蛋白酶時酶，計劃實驗，以使FLICA在細胞中預期胱天蛋白酶被激活時被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300µL細胞10µL3-5 x 105細胞/mL，但數量可能因實驗而異條件和用于分析的儀器。每位研究者應調整FLICA的量以適應特定細胞系研究條件。

將細胞培養至適合特定實驗條件的最佳密度或凋亡誘導方案。細胞密度不應超過106細胞/

超過此濃度培養的細胞可開始自然生長進入凋亡。可能需要進行初步實驗來確定何時以及使用多少FLICA作為產生的正信號是培養過程中caspase活性的直接測量時期.

圖：Jurkat細胞（T淋巴細胞）用ICT的綠色FAM-LICA標記聚半胱天冬酶抑制劑FAM-VAD-FMK（試劑盒#92）顯微鏡熒光。灰色DIC圖像（B）顯示了但其中只有四個發出綠色熒光（A）。四個（共個）5個細胞凋亡，并存在活性胱天蛋白酶（綠色）。