基本方法（一）用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。
4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測O•D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O•D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
基本方法（二）用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對照）
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
ELISA常用的四種方法
1．直接法測定抗原 :將抗原吸附在載體表面；加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．間接法測定抗體:將抗原吸附于固相載體表面；加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物；加酶標(biāo)抗體；加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。
3．雙抗體夾心法測定抗原:將抗原免疫種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;加酶標(biāo)抗抗體（第二種動(dòng)物抗體的抗體）; 加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 競爭法測定抗原:將抗體吸附在固相載體表面;加入酶標(biāo)抗原；加入酶標(biāo)抗原和待測抗原；加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
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